Il nostro protocollo fornisce un approccio facile e veloce per l'isolamento primario dei fibroblasti con una chiara attenzione all'evitare la contaminazione batterica, che può essere un problema enorme. Soprattutto per i principianti. Il vantaggio principale della nostra tecnica è la sua semplicità.
Poiché non richiede ampie abilità manuali o esperienza e può essere facilmente appreso da tutti in un breve periodo di formazione. A presentare la tecnica sarà Manja Newe, tecnico di fuori laboratorio. Prima di iniziare la dissezione, indossare due paia di guanti monouso, uno sopra l'altro.
E fissare il mouse a un pad in polistirolo. Disinfettare la pelliccia con il 70% di etanolo, assicurandosi che l'animale sia imbevuto. E utilizzare forcep chirurgiche sterilizzate con etanolo e forbici atraumatiche per intasare la pelle proprio sopra il tratto urogenitale.
Tagliare da tre a quattro centimetri lungo la linea mediana dall'incisione iniziale al collo, aggiungendo tagli di rilievo agli arti. E fissare la pelle al pad per ottenere un accesso ottimale alla muscolatura che copre la cavità addominale. Quindi, disinfettare la muscolatura addominale due volte con 70% di etanolo fresco.
Quando l'etanolo si è asciugato, rimuovere il primo paio di guanti. E usa un nuovo set sterile di forcep e forbici per incidere lo strato muscolare per aprire la cavità addominale e il torace. Per rimuovere gli organi di interesse, afferrare delicatamente ogni organo con le forcelle chirurgiche senza perforare il tessuto.
E usa le forbici per tagliare con cura i vasi sanguigni fornitori vicino al punto di ingresso dell'organo. Posizionare ogni organo in un tubo di PBS sterile e freddo e chiudere saldamente il tubo. Posizionare ogni tubo sul ghiaccio bagnato mentre gli organi vengono raccolti.
Una volta raccolti tutti gli organi, spruzzare i tubi con il 70% di etanolo prima di metterli in una cappa sterile per la coltura cellulare. Indossando un paio di guanti freschi, utilizzare forcep sterili per trasferire ogni organo su una metà di una piastra di Petri sterile di sei centimetri. E lavare brevemente gli organi con PBS fresco per rimuovere il sangue in eccesso.
Trasferire gli organi risciacquati nella seconda metà di ogni piastra di Petri e rimuovere il PBS in eccesso. Usando due bisturi sterili, tritare gli organi in frammenti da uno a due millimetri. E usa una spatola sterile per trasferire i pezzi di tessuto in nuovi tubi nuovi, individuali, sterili, da 15 millilitri.
Aggiungere due millilitri di soluzione di trypsina allo 0,25% ad ogni tubo. E posizionare i tubi in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Alla fine dell'incubazione, vortice i tubi a circa 1400 rotazioni al minuto per dieci secondi.
E arrestare la reazione della triptina con quattro millilitri di un mezzo di coltura appropriato integrato con siero fetale del vitello per tubo. Quindi, aggiungere il volume appropriato di soluzione di miscela di collagenasi a ciascun tubo. E posizionare i tubi in un bagno d'acqua ad ultrasuoni di 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Al termine della sonicazione, vortice delicatamente i tubi per 10 secondi. Prima di riposizionare i tubi nel bagno d'acqua ad ultrasuoni per altri 10 minuti. Alla fine della seconda sonicazione, vortice i tubi per altri 10 secondi.
E disinfettare i tubi con il 70% di etanolo. Nella cappa di coltura cellulare, filtrare le sospensioni cellulari attraverso singoli filtri da 40 micrometri in un nuovo tubo sterile da 15 millilitri. E raccogliere le cellule per centrifugazione.
Sospendere di nuovo i pellet in un millilitro di mezzo fresco per tubo. E vedere le cellule in vasi di coltura cellulare adatti a densità di placcatura appropriate. Quindi, posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare durante la notte.
La mattina seguente, lavare ogni coltura tre volte con PBS prima di aggiungere mezzo fresco e restituire le cellule all'incubatore. Utilizzando questo protocollo, i fibroblasti vitali possono essere ottenuti per l'uso in esperimenti successivi. Come la colorazione ammino-fluorescente o gli esperimenti di proliferazione.
I fibroblasti adulti sono cellule piatte a forma di mandrino con molteplici processi cellulari che in genere crescono nei monostrati. Tuttavia, si possono osservare differenze morfologiche distinte nelle popolazioni di fibroblasti provenienti da diversi organi. Ad esempio, i fibroblasti renali sono più piccoli e crescono a densità più elevate rispetto ai fibroblasti cardiaci, polmonari o epatici.
I fibroblasti isolati mostrano alti tassi di proliferazione, raggiungendo una confluenza ottica superiore al 90% dopo circa sei giorni. Qui, si può osservare un miofibroblasto differenziato con caratteristici microfilamenti alfa lisci dell'actina muscolare liscia. Queste cellule si trovano in abbondanza nelle colture cardiache, renali, epatiche e cellulari polmonari.
Mentre solo circa il 20-30% delle cellule isolate e coltivate esprime in modo ordinato, disposto, alfa liscio i microfilamenti dell'actina muscolare, praticamente tutte le cellule sono positive per Vimentin e Discoidin Domain Receptor 2 dopo sette giorni di coltura. La cosa più importante da ricordare è usare la tecnica giusta durante tutta la procedura poiché la contaminazione batterica deve essere evitata. Dopo l'isolamento primario dei fibroblasti, le cellule possono essere utilizzate per tutti i tipi di esperimenti di psichiatria e caratterizzazione.
Come la proliferazione della chimica immunocitica o saggi di guarigione delle ferite, o valutazioni biologiche molecolari.
