Authors have nothing to disclose.

Il protocollo per eseguire esperimenti sugli animali, le motivazioni e gli obiettivi della ricerca, sono stati presentati e approvati dalla University of Southern California Istituzionale Animal Care and Use Committee. Il protocollo per la creazione di colture primarie da campioni esofagectomia umani de-identificati è stato approvato dalla University of Southern California Institutional Review Board. 1. Ottenere Mouse o Esofago umano <ol><li> Ottenere mouse Esofago: <ol><li> Euthanize il 8-12 giorno vecchio mouse con 2% isoflurano overdose inalanti seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Pin dell&#39;animale con la pancia rivolta verso l&#39;alto e bagnare la superficie ventrale con il 70% di etanolo. Con pinze, afferrare e sollevare la pelle anteriori all&#39;apertura uretrale con una pinza. Usare le forbici chirurgiche standard, dritto per tagliare lungo la linea mediana ventrale dall&#39;apertura uretrale al mento. Fare attenzione a tagliare solo la pelle. &lt;/ Li&gt; <li> Fare un&#39;incisione dall&#39;apertura verso il basso per il ginocchio su entrambi i lati di un animale uretrale, formando una testa in giù &quot;Y&quot;. Fare un&#39;altra incisione su entrambi i lati di un animale lungo la gabbia toracica. </li><li> Sbucciare con cura la pelle su entrambi i lati, al largo del peritoneo sottostante e la gabbia toracica, e porre ai lati. Esaminate la gabbia toracica sovrastante la cavità toracica e il peritoneo sovrastante la cavità addominale. <ol><li> Sollevare il peritoneo con una pinza e tagliare fino alla gabbia toracica e diaframma, che punta verso l&#39;alto le forbici per evitare danni al contenuto addominale. Sollevare delicatamente il lobo sinistro del fegato, esporre lo stomaco sottostante, la giunzione esofago-gastrica e la porzione addominale dell&#39;esofago. </li></ol></li><li> Usare le forbici chirurgiche in autoclave per tagliare lo sterno e costole lungo la linea mediana fino alla cintura cervicale. Forbici Point verso l&#39;alto per evitare di danneggiare il contenuto del torace. Esporre completamente il contenuto delcavità toracica tirando la gabbia toracica ai lati. </li><li> Rimuovere delicatamente il cuore e entrambi i lobi dei polmoni. Assorbire il sangue in eccesso con Q-punte. L&#39;esofago toracico è una stretta, tubo mentire posteriore flessibile alla trachea e anteriore al vertebra toracica. NOTA: L&#39;esofago può essere difficile da individuare nei neonati murini. La localizzazione della giunzione esofago-gastrica rende identificazione esofageo semplice. </li><li> Seguire attentamente l&#39;esofago dallo stomaco, sezionando il circostante vascolare, grasso e mesentere tutta la strada fino all&#39;origine esofagea nella cavità cervicale. Forbici chirurgiche con punta smussata funzionano meglio per questo scopo. </li><li> Resecare l&#39;intera lunghezza dell&#39;esofago e posto in soluzione salina bilanciata Hanks &#39;(HBSS) per l&#39;ulteriore elaborazione descritto di seguito. Rimuovere una porzione dello stomaco per orientazione se desiderato. NOTA: A causa delle dimensioni piccole del tessuto, la separazione di muscolare propria del muscoloè mucosa non è realizzabile in murino neonato esofago e l&#39;intero esofago è sottoposto al trattamento descritto di seguito. </li></ol></li><li> Ottenere Esofago umano: <ol><li> Lavare i campioni di resezione esofagea (in genere 5 cm o meno) con HBSS e rimuovere qualsiasi tessuto connettivo, il grasso, o vascolare allegato. </li><li> Resecare una porzione del campione e porre in formalina per futuro esame istologico se desiderato. </li><li> Separare i restanti mucosa dal sottostante muscolare propria da dissezione tagliente. </li><li> Tagliare mucosa in frammenti sub centimetri e soggetti al protocollo descritto di seguito. NOTA: resezioni esofago umani può essere conservato in PBS per un massimo di 6 ore prima del trattamento descritto di seguito. Fonte di esemplari esofagectomia detterà le dimensioni del campione e sarà dipendente da laboratorio. </li></ol></li></ol> 2. Isolare murini ed umani esofageo stromali Cells <ol><li> Isolare cellule stromali esofagee from murino e tessuti umani da una combinazione di digestione enzimatica e meccanica. <ol><li> Meccanicamente digerire sminuzzando il tessuto con le forbici e molteplici lavaggi con HBSS. Enzimaticamente digerire incubando il tessuto con 300 U / ml di collagenasi XI e 0,1 mg / ml dispasi per 25 min (tessuto murino) o fino a 6 ore (tessuti umani). Assicurarsi che gli strumenti utilizzati per la macinazione sono stati autoclavato e sterilizzato. NOTA: collagenasi sono enzimi che degradano il collagene, una proteina della matrice extracellulare responsabile per lo svolgimento di tessuti animali insieme. Collagenase XI ha un&#39;elevata attività collagenasi e ha visto il successo in questo protocollo isolamento. Dispasi è un enzima batterico con lieve attività proteolitica dissociazione che conserva l&#39;attività membrana cellulare ed è utilizzato in combinazione con collagenasi come un enzima secondario. </li><li> Mettere i frammenti della mucosa ottenuti da mouse o tessuti umani in 1,7 ml di micro-centrifuga o 5 ml provette contenenti rispettivamente, HBSS. Tessuto Mince ulteriormentein 2-3 pezzi mm con le forbici con una larghezza punta aperta che si adatta in rispettive provette. Lasciare tempo sufficiente per consentire frammenti mucosa esofagea a sedimentare sul fondo della provetta. </li><li> Lentamente decantare HBSS, facendo attenzione a non eliminare inavvertitamente il tessuto. Sostituire con fresco HBSS seguito da un leggero scuotimento. In alternativa, rimuovere HBSS con una pipetta 1 ml. </li><li> Lavare il tessuto in questo modo un totale di 8 volte con agitando delicatamente tra lavaggi permettendo tempo per frammenti esofagee a sedimentare tra ogni lavaggio. NOTA: il tessuto umano richiederà più tritare che il tessuto del mouse neonato. </li></ol></li><li> Incubare tessuto murino con 300 U / ml di collagenasi XI e 0,1 mg / ml dispasi per 25 minuti su un agitatore dondolo impostato a velocità ridotta a temperatura ambiente. <ol><li> Incubare tessuto umano con 300 U / ml di collagenasi XI e 0,1 mg / ml dispasi fino a 6 ore, su un agitatore dondolo impostato a velocità ridotta a temperatura ambiente. NOTA: la disponibilità di esopha umanaGus è variabile. Mucosa esofagea umana incubate con enzimi per un massimo di 6 risultati h in successo generazione di colture primarie. </li></ol></li><li> Dopo la digestione enzimatica, tritare il tessuto ulteriormente con le forbici e centrifugare a 200 xg per 10 min. </li><li> Scartare il surnatante. Trasferire il pellet, costituito da una sospensione cellulare mista in una provetta 5 ml e lavare 5 volte a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) addizionato con 2% sorbitolo di eliminare le cellule non vitali e detriti. </li><li> Cellule seme in 6 pozzetti e la cultura in DMEM con siero fetale bovino al 10% (FB), 10 mg / ml di insulina, 10 mcg / ml transferrina, 10 mg / ml gentamicina, e 2 ng / ml il fattore di crescita epidermico (EGF) . Filtro sottovuoto (0,22 micron) tutti i componenti ad eccezione del FEG, che possono essere aggiunti dopo la filtrazione. Distribuire cellule ottenute da campioni di resezione umani tra più 6 pozzetti, a seconda delle dimensioni di resezione. </li><li> Una volta che i pozzi sono 80% confluenti, passaggio cellule aderenti a T25 noi Borraccieing 0,05% tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Neutralizzare con i media e far girare a 400 x g. <ol><li> Per un passaggio 6 e ad un pallone T25, cellule di passaggio in un rapporto 1: 1. Fiasche T25 Confluent possono essere diversi passaggi in un rapporto 1: 3: 2 o 1. Per passare da un pallone in un pallone T25 T75, utilizzare un rapporto 1: 1. Cambia i media ogni 2-3 giorni, indipendentemente della nave. </li><li> Crescere le cellule a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore e la cultura nei media miofibroblasti sopra descritti. NOTA: le cellule epiteliali non sopravvivono in queste condizioni di coltura o di passaggio. Le cellule utilizzate per la caratterizzazione e negli studi descritti di seguito sono tra i passaggi 5 e 15. </li><li> Cryo-conservare le cellule in N liquido 2 aggiungendo 10% dimetilsolfossido ai media miofibroblasti. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzare murini ed umani esofageo stromali Cells <ol><li> Esaminate la morfologia delle cellule con un microscopio invertito. Osservare il fusiformemorfologia delle cellule aderenti (Figura 1). </li><li> Caratterizzare cellule in coltura per la valutazione dei seguenti marcatori del citoscheletro: α-SMA, vimentina, desmina, e citocheratina. Cellule stromali con fenotipo miofibroblasti simile esprimono marcatori miofibroblasti citoscheletro α-SMA e vimentina (Figura 2). <ol><li> Per distinguere ulteriormente cellule stromali coltivate da cellule muscolari, immunostain per desmina. Per eseguire immunoistochimica su cellule in coltura, piatto 1,5 x 10 4 cellule diapositive da camera a 4 così e crescere in mezzi miofibroblasti per 24 ore. Cellule stromali con fenotipo miofibroblasti simile avranno espressione desmin debole o assente. Cellule stromali mancano espressione del marcatore epiteliale pan-citocheratina (dati non mostrati). NOTA: La valutazione di culture include la valutazione dei marcatori del citoscheletro mediante immunocitochimica e superficie cellulare marcatori di citometria a flusso. Immunocitochimica viene utilizzato come metodo primario di caratterizzazione come exProfilo pressione di proteine ​​del citoscheletro è unico per la fibroblasti, miofibroblasti e cellule muscolari. Stabilisce citometria a flusso cultura purezza valutando l&#39;espressione di superficie cellulare epiteliale, endoteliale, e cellule ematopoietiche marcatori. CD90 è utile come un metodo aggiuntivo di identificare cellule stromali umane si esprime su entrambi i fibroblasti umani e miofibroblasti. CD90 non è utile per la caratterizzazione di cellule stromali murine come anche espresso dalle cellule T murine. </li></ol></li><li> Dopo cellule raggiungono il 60% di confluenza, risciacquare diapositive con tampone fosfato salino (PBS) e fissare con metanolo. Incubare le cellule in metanolo per 10 min a -20 ° C, quindi memorizzare in PBS a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Seguire protocollo immunostaining standard. </li><li> Brevemente, prima di applicare l&#39;anticorpo primario, bloccare le cellule fissate con 5% goatserum in PBS. Diluire gli anticorpi primari e secondari nel siero di capra 5% pure. <ol><li> Per il rilevamento di α-SMA e vimentina, utilizzare ilseguenti anticorpi e concentrazioni: mouse mAB di α-SMA a 1: 250 diluizione e coniglio pAB a vimentin a 1: 500 di diluizione. </li><li> Incubare con l&#39;anticorpo primario a temperatura ambiente per una notte a 4 ° C, lavare 3 volte con PBS e aggiungere anticorpi secondari Rodamina capra coniugato anti-topo a una diluizione di 1: 200 e Cy2 capra coniugato anti- coniglio ad una diluizione di 1: 1000 per 1 hr a temperatura ambiente. </li><li> Nuclei di contrasto con 4 &#39;, 6-Diamidino-2Phenylindole (DAPI) ad una concentrazione di 1 mg / ml per 1 min e poi lavare con PBS. Analizzare vetrini con un microscopio invertito. </li></ol></li><li> Stabilire purezza delle culture esame delle cellule esofagee murine e umane per ematopoietiche (CD45) e endoteliale (CD31) marcatori di superficie cellulare mediante citometria di flusso (Figura 3). Caratterizzare cellule umane ulteriormente espressione del cellule stromali marcatore di superficie CD90. NOTA: CD90 non può essere utilizzato per identificare le cellule stromali murine come murine T cells esprimono CD90. <ol><li> Staccare coltivate cellule stromali del mouse esofageo dalle beute di coltura mediante trattamento con cellule non-enzimatica dissociazione soluzione a 37 ° C per 10 minuti, lavate con tampone FACS due volte, contate e colorati con FITC-CD45 e CD31-APC con relativi controlli isotipici, secondo alle procedure standard di colorazione. </li><li> Raccogliere cellule utilizzando FACS Calibur e analizzare i dati con il software FlowJo. Prima di cellule colorazione, ottimizzare gli anticorpi e titolare concentrazioni con controlli isotipici, normale milza del mouse, e le cellule del midollo osseo. </li></ol></li></ol>

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Questo lavoro è supportato da NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Campana Institute of Health e Nutrition Research Scholar Award in Gut Fisiologia e la salute (AS) e Wright Foundation Pilot Award (AS).

Le tecniche per la generazione di colture primarie sono generalmente simile usando il tessuto murino o umano con tritare e digestione volte adattati per dimensioni del tessuto. La nostra esperienza con il tessuto murino suggerisce che con i metodi sopra descritti costantemente comporta successo creazione di colture primarie. Passaggi critici nel protocollo comprendono la sterilizzazione di attrezzature chirurgiche e seguendo le tecniche sterili standard di coltura di tessuti. L&#39;età dei topi è anche un passaggio cr...

Interazioni epiteliali-stromale sono coinvolti nella regolazione di una varietà di funzioni del tratto gastrointestinale, tra cui la rigenerazione della mucosa, la riparazione, la fibrosi e la carcinogenesi 1,2. Queste interazioni sono state meglio studiate nel piccolo intestino e colon e possono svolgere un ruolo simile in alterazioni della mucosa esofagea 3. Una sottopopolazione di cellule stromali miofibroblasti intestinali e del colon chiamati è stata dimostrata a partecipare a mediare lesioni dei tessuti, l&#39;infiammazione e la riparazione di 4,5. Nel tratto GI distale, queste cellule fusiformi sono adiacenti alla membrana basale all&#39;interfaccia tra l&#39;epitelio e lamina propria e sono definiti come α-SMA e vimentina positivo, pan-citocheratina negative, e debolmente positivo o negativo desmina 5. Lo stroma esofagea non è stato rigorosamente caratterizzato a livello cellulare o molecolare. Il nostro lavoro in esofago murino ha demonstrated α-SMA cellule e vimentina nello stroma esofageo, di tanto in tanto soggiacenti alla epitelio squamoso 6. Interazioni epiteliali-stromale sono stati implicati in alterazioni della mucosa esofagea quali gastro-esofageo danno mediato 6 e esofagite eosinofila 3. Stenosi fibrotiche sono anche una complicanza nota di cellule stromali e lesioni esofagee sono stati implicati nella patogenesi della fibrosi gastrointestinale. L&#39;isolamento di queste cellule aiuterà compiere gli studi necessari per indagare vie di segnalazione squilibrati. Questa presentazione fornisce le tecniche necessarie per stabilire colture primarie di α-SMA positive, miofibroblasti positivi vimentina tale che le lacune esistenti nella conoscenza per quanto riguarda le vie di segnalazione che mediano queste interazioni possono essere affrontati. La tecnica descritta è stata utilizzata con successo dagli autori per stabilire miofibroblasti primari murini colon 7 e further adattato per l&#39;istituzione di murine 6 e cellule stromali esofagee miofibroblasti come umani. Qui descriviamo le condizioni necessarie per realizzare e caratterizzare queste culture stabilite dal mouse o esofago umano prima dell&#39;uso in studi funzionali futuri. Le culture possono essere coltivate e utilizzate fino a 15 passaggi. Isolamento e la creazione di colture primarie tramite le modalità descritte di seguito genera cellule stromali con fenotipo miofibroblasti; α-SMA, vimentina positivo, e debolmente positivo o negativo per la desmina, e citocheratina negativo. Questo fenotipo è distinto dal fenotipo del fibroblasto esofageo che è prevalentemente vimentina positivo, α-SMA negative 3 o α-SMA positive, vimentina fenotipo negativo della muscolaris mucosae 6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:549px;">Name</td>
			<td style="width:549px;"></td>
			<td style="width:549px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dispase&#160;</td>
			<td>GIBCO, Invitrogen</td>
			<td>&#160;17105-041</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>C9407&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO, Invitrogen&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sorbitol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma)</td>
			<td>F42442</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">transferrin&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10-652-202-001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-Cl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">epidermal growth factor&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;25-052-Cl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagents for immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse mAB to &#945;-SMA&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7817</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit pAB to vimentin&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab45939</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy2 conjugated Goat anti Rabbit&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-225-144</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI&#160;</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>D8417</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD31 conjugated to eFluor 450&#160;</td>
			<td>ebiosciences</td>
			<td>48-0319-410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD90 conjugated to APC&#160;</td>
			<td>ebiosciences&#160;</td>
			<td>17-0909-41&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Annexin V and 7AAD&#160;</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>559763</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Fc block for CD16/CD32&#160;</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>2136662</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml tube&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Motic AE31 inverted microscope</td>
			<td>Motic AE31 inverted microscope</td>
			<td>Motic AE31 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators</td>
			<td>Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators</td>
			<td>Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-well chamber slides&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177437</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Olympus Vacuum-Driven Filter System&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>25-227</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T25 Flasks&#160;</td>
			<td>TRP&#160;</td>
			<td>90026</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T75 Flasks&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43064</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissection Scissors</td>
			<td>Dissection Scissors</td>
			<td>Dissection Scissors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Forceps</td>
			<td>Dissection Forceps</td>
			<td>Dissection Forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Tipped Q-Tips&#160;</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>540500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T75 Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43064</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metamorph software (Molecular Devices)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACSCAlibur&#160;</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACSVerse</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of myofibroblasts from mouse and human esophagus

Murine e umane esofagea miofibroblasti sono generati tramite digestione enzimatica. Neonato (8-12 giorni di età) murino esofago viene raccolto, tritata, lavata, e sottoposto a digestione enzimatica con collagenasi e dispasi per 25 min. I campioni di resezione esofagea umani sono spogliati di muscolare propria e avventizia e la mucosa restante viene macinata, e sottoposti a digestione enzimatica con collagenasi e dispasi per un massimo di 6 ore. Cellule in coltura esprimono α-SMA e vimentina e desmina espresso debolmente o per niente. Condizioni di coltura non sono favorevole alla crescita di epiteliale, ematopoietiche o cellule endoteliali. Cultura purezza è ulteriormente confermata da una valutazione citometria a flusso di espressione marcatore superficie cellulare del potenziale contaminante ematopoietiche ed endoteliali. La tecnica descritta è semplice e si traduce nella generazione coerente non hematopoieitc, cellule stromali non endoteliali. Limitazioni di questa tecnica sono inerenti all&#39;uso dicolture primarie di studi di biologia molecolare, cioè, la variabilità inevitabile incontrato tra le culture stabilite in diversi topi e nell&#39;uomo. Colture primarie, tuttavia, sono una riflessione più rappresentativo dello stato in vivo rispetto alle linee cellulari. Questi metodi forniscono anche gli investigatori la possibilità di isolare e cellule stromali cultura di diverse condizioni cliniche e sperimentali, permettendo il confronto tra gruppi. Cellule stromali esofagee caratterizzato possono essere utilizzati anche in studi funzionali in relazione alle interazioni epiteliali-stroma nei disturbi esofagei.

Cellule stromali esofagee isolate mediante digestione meccanica ed enzimatica sono inizialmente placcati e coltivate in 6 pozzetti. Esame di cellule con un microscopio invertito entro ore di placcatura dimostra una sospensione cellulare mista vagamente aderente alla piastra inferiore (Figura 1A). Nel prossimo 24 ore, le cellule fusiformi saldamente aderenti al fondo piatto sono osservate ripresa dalla sospensione cellulare mista (Figura 1B) .Questi cellule germinali coprono l&#39;intera...

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Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

isolation-of-myofibroblasts-from-mouse-and-human-esophagus

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  Keck School of Medicine, University of Southern California. We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions. 

Video: Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento del DNA genomico da Tails mouse

Ricerca

Biologia

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

Isolamento Manuale di cellule staminali derivate da tessuto adiposo da lipoaspirato umani

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Isolamento di microvascolare endoteliale tubi da arterie di resistenza mouse

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

Isolamento dei Piccoli RNA non codificanti dal siero umano

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...