Authors have nothing to disclose.

Il protocollo per eseguire esperimenti sugli animali, le motivazioni e gli obiettivi della ricerca, sono stati presentati e approvati dalla University of Southern California Istituzionale Animal Care and Use Committee. Il protocollo per la creazione di colture primarie da campioni esofagectomia umani de-identificati è stato approvato dalla University of Southern California Institutional Review Board. 1. Ottenere Mouse o Esofago umano <ol><li> Ottenere mouse Esofago: <ol><li> Euthanize il 8-12 giorno vecchio mouse con 2% isoflurano overdose inalanti seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Pin dell&#39;animale con la pancia rivolta verso l&#39;alto e bagnare la superficie ventrale con il 70% di etanolo. Con pinze, afferrare e sollevare la pelle anteriori all&#39;apertura uretrale con una pinza. Usare le forbici chirurgiche standard, dritto per tagliare lungo la linea mediana ventrale dall&#39;apertura uretrale al mento. Fare attenzione a tagliare solo la pelle. &lt;/ Li&gt; <li> Fare un&#39;incisione dall&#39;apertura verso il basso per il ginocchio su entrambi i lati di un animale uretrale, formando una testa in giù &quot;Y&quot;. Fare un&#39;altra incisione su entrambi i lati di un animale lungo la gabbia toracica. </li><li> Sbucciare con cura la pelle su entrambi i lati, al largo del peritoneo sottostante e la gabbia toracica, e porre ai lati. Esaminate la gabbia toracica sovrastante la cavità toracica e il peritoneo sovrastante la cavità addominale. <ol><li> Sollevare il peritoneo con una pinza e tagliare fino alla gabbia toracica e diaframma, che punta verso l&#39;alto le forbici per evitare danni al contenuto addominale. Sollevare delicatamente il lobo sinistro del fegato, esporre lo stomaco sottostante, la giunzione esofago-gastrica e la porzione addominale dell&#39;esofago. </li></ol></li><li> Usare le forbici chirurgiche in autoclave per tagliare lo sterno e costole lungo la linea mediana fino alla cintura cervicale. Forbici Point verso l&#39;alto per evitare di danneggiare il contenuto del torace. Esporre completamente il contenuto delcavità toracica tirando la gabbia toracica ai lati. </li><li> Rimuovere delicatamente il cuore e entrambi i lobi dei polmoni. Assorbire il sangue in eccesso con Q-punte. L&#39;esofago toracico è una stretta, tubo mentire posteriore flessibile alla trachea e anteriore al vertebra toracica. NOTA: L&#39;esofago può essere difficile da individuare nei neonati murini. La localizzazione della giunzione esofago-gastrica rende identificazione esofageo semplice. </li><li> Seguire attentamente l&#39;esofago dallo stomaco, sezionando il circostante vascolare, grasso e mesentere tutta la strada fino all&#39;origine esofagea nella cavità cervicale. Forbici chirurgiche con punta smussata funzionano meglio per questo scopo. </li><li> Resecare l&#39;intera lunghezza dell&#39;esofago e posto in soluzione salina bilanciata Hanks &#39;(HBSS) per l&#39;ulteriore elaborazione descritto di seguito. Rimuovere una porzione dello stomaco per orientazione se desiderato. NOTA: A causa delle dimensioni piccole del tessuto, la separazione di muscolare propria del muscoloè mucosa non è realizzabile in murino neonato esofago e l&#39;intero esofago è sottoposto al trattamento descritto di seguito. </li></ol></li><li> Ottenere Esofago umano: <ol><li> Lavare i campioni di resezione esofagea (in genere 5 cm o meno) con HBSS e rimuovere qualsiasi tessuto connettivo, il grasso, o vascolare allegato. </li><li> Resecare una porzione del campione e porre in formalina per futuro esame istologico se desiderato. </li><li> Separare i restanti mucosa dal sottostante muscolare propria da dissezione tagliente. </li><li> Tagliare mucosa in frammenti sub centimetri e soggetti al protocollo descritto di seguito. NOTA: resezioni esofago umani può essere conservato in PBS per un massimo di 6 ore prima del trattamento descritto di seguito. Fonte di esemplari esofagectomia detterà le dimensioni del campione e sarà dipendente da laboratorio. </li></ol></li></ol> 2. Isolare murini ed umani esofageo stromali Cells <ol><li> Isolare cellule stromali esofagee from murino e tessuti umani da una combinazione di digestione enzimatica e meccanica. <ol><li> Meccanicamente digerire sminuzzando il tessuto con le forbici e molteplici lavaggi con HBSS. Enzimaticamente digerire incubando il tessuto con 300 U / ml di collagenasi XI e 0,1 mg / ml dispasi per 25 min (tessuto murino) o fino a 6 ore (tessuti umani). Assicurarsi che gli strumenti utilizzati per la macinazione sono stati autoclavato e sterilizzato. NOTA: collagenasi sono enzimi che degradano il collagene, una proteina della matrice extracellulare responsabile per lo svolgimento di tessuti animali insieme. Collagenase XI ha un&#39;elevata attività collagenasi e ha visto il successo in questo protocollo isolamento. Dispasi è un enzima batterico con lieve attività proteolitica dissociazione che conserva l&#39;attività membrana cellulare ed è utilizzato in combinazione con collagenasi come un enzima secondario. </li><li> Mettere i frammenti della mucosa ottenuti da mouse o tessuti umani in 1,7 ml di micro-centrifuga o 5 ml provette contenenti rispettivamente, HBSS. Tessuto Mince ulteriormentein 2-3 pezzi mm con le forbici con una larghezza punta aperta che si adatta in rispettive provette. Lasciare tempo sufficiente per consentire frammenti mucosa esofagea a sedimentare sul fondo della provetta. </li><li> Lentamente decantare HBSS, facendo attenzione a non eliminare inavvertitamente il tessuto. Sostituire con fresco HBSS seguito da un leggero scuotimento. In alternativa, rimuovere HBSS con una pipetta 1 ml. </li><li> Lavare il tessuto in questo modo un totale di 8 volte con agitando delicatamente tra lavaggi permettendo tempo per frammenti esofagee a sedimentare tra ogni lavaggio. NOTA: il tessuto umano richiederà più tritare che il tessuto del mouse neonato. </li></ol></li><li> Incubare tessuto murino con 300 U / ml di collagenasi XI e 0,1 mg / ml dispasi per 25 minuti su un agitatore dondolo impostato a velocità ridotta a temperatura ambiente. <ol><li> Incubare tessuto umano con 300 U / ml di collagenasi XI e 0,1 mg / ml dispasi fino a 6 ore, su un agitatore dondolo impostato a velocità ridotta a temperatura ambiente. NOTA: la disponibilità di esopha umanaGus è variabile. Mucosa esofagea umana incubate con enzimi per un massimo di 6 risultati h in successo generazione di colture primarie. </li></ol></li><li> Dopo la digestione enzimatica, tritare il tessuto ulteriormente con le forbici e centrifugare a 200 xg per 10 min. </li><li> Scartare il surnatante. Trasferire il pellet, costituito da una sospensione cellulare mista in una provetta 5 ml e lavare 5 volte a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) addizionato con 2% sorbitolo di eliminare le cellule non vitali e detriti. </li><li> Cellule seme in 6 pozzetti e la cultura in DMEM con siero fetale bovino al 10% (FB), 10 mg / ml di insulina, 10 mcg / ml transferrina, 10 mg / ml gentamicina, e 2 ng / ml il fattore di crescita epidermico (EGF) . Filtro sottovuoto (0,22 micron) tutti i componenti ad eccezione del FEG, che possono essere aggiunti dopo la filtrazione. Distribuire cellule ottenute da campioni di resezione umani tra più 6 pozzetti, a seconda delle dimensioni di resezione. </li><li> Una volta che i pozzi sono 80% confluenti, passaggio cellule aderenti a T25 noi Borraccieing 0,05% tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Neutralizzare con i media e far girare a 400 x g. <ol><li> Per un passaggio 6 e ad un pallone T25, cellule di passaggio in un rapporto 1: 1. Fiasche T25 Confluent possono essere diversi passaggi in un rapporto 1: 3: 2 o 1. Per passare da un pallone in un pallone T25 T75, utilizzare un rapporto 1: 1. Cambia i media ogni 2-3 giorni, indipendentemente della nave. </li><li> Crescere le cellule a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore e la cultura nei media miofibroblasti sopra descritti. NOTA: le cellule epiteliali non sopravvivono in queste condizioni di coltura o di passaggio. Le cellule utilizzate per la caratterizzazione e negli studi descritti di seguito sono tra i passaggi 5 e 15. </li><li> Cryo-conservare le cellule in N liquido 2 aggiungendo 10% dimetilsolfossido ai media miofibroblasti. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzare murini ed umani esofageo stromali Cells <ol><li> Esaminate la morfologia delle cellule con un microscopio invertito. Osservare il fusiformemorfologia delle cellule aderenti (Figura 1). </li><li> Caratterizzare cellule in coltura per la valutazione dei seguenti marcatori del citoscheletro: α-SMA, vimentina, desmina, e citocheratina. Cellule stromali con fenotipo miofibroblasti simile esprimono marcatori miofibroblasti citoscheletro α-SMA e vimentina (Figura 2). <ol><li> Per distinguere ulteriormente cellule stromali coltivate da cellule muscolari, immunostain per desmina. Per eseguire immunoistochimica su cellule in coltura, piatto 1,5 x 10 4 cellule diapositive da camera a 4 così e crescere in mezzi miofibroblasti per 24 ore. Cellule stromali con fenotipo miofibroblasti simile avranno espressione desmin debole o assente. Cellule stromali mancano espressione del marcatore epiteliale pan-citocheratina (dati non mostrati). NOTA: La valutazione di culture include la valutazione dei marcatori del citoscheletro mediante immunocitochimica e superficie cellulare marcatori di citometria a flusso. Immunocitochimica viene utilizzato come metodo primario di caratterizzazione come exProfilo pressione di proteine ​​del citoscheletro è unico per la fibroblasti, miofibroblasti e cellule muscolari. Stabilisce citometria a flusso cultura purezza valutando l&#39;espressione di superficie cellulare epiteliale, endoteliale, e cellule ematopoietiche marcatori. CD90 è utile come un metodo aggiuntivo di identificare cellule stromali umane si esprime su entrambi i fibroblasti umani e miofibroblasti. CD90 non è utile per la caratterizzazione di cellule stromali murine come anche espresso dalle cellule T murine. </li></ol></li><li> Dopo cellule raggiungono il 60% di confluenza, risciacquare diapositive con tampone fosfato salino (PBS) e fissare con metanolo. Incubare le cellule in metanolo per 10 min a -20 ° C, quindi memorizzare in PBS a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Seguire protocollo immunostaining standard. </li><li> Brevemente, prima di applicare l&#39;anticorpo primario, bloccare le cellule fissate con 5% goatserum in PBS. Diluire gli anticorpi primari e secondari nel siero di capra 5% pure. <ol><li> Per il rilevamento di α-SMA e vimentina, utilizzare ilseguenti anticorpi e concentrazioni: mouse mAB di α-SMA a 1: 250 diluizione e coniglio pAB a vimentin a 1: 500 di diluizione. </li><li> Incubare con l&#39;anticorpo primario a temperatura ambiente per una notte a 4 ° C, lavare 3 volte con PBS e aggiungere anticorpi secondari Rodamina capra coniugato anti-topo a una diluizione di 1: 200 e Cy2 capra coniugato anti- coniglio ad una diluizione di 1: 1000 per 1 hr a temperatura ambiente. </li><li> Nuclei di contrasto con 4 &#39;, 6-Diamidino-2Phenylindole (DAPI) ad una concentrazione di 1 mg / ml per 1 min e poi lavare con PBS. Analizzare vetrini con un microscopio invertito. </li></ol></li><li> Stabilire purezza delle culture esame delle cellule esofagee murine e umane per ematopoietiche (CD45) e endoteliale (CD31) marcatori di superficie cellulare mediante citometria di flusso (Figura 3). Caratterizzare cellule umane ulteriormente espressione del cellule stromali marcatore di superficie CD90. NOTA: CD90 non può essere utilizzato per identificare le cellule stromali murine come murine T cells esprimono CD90. <ol><li> Staccare coltivate cellule stromali del mouse esofageo dalle beute di coltura mediante trattamento con cellule non-enzimatica dissociazione soluzione a 37 ° C per 10 minuti, lavate con tampone FACS due volte, contate e colorati con FITC-CD45 e CD31-APC con relativi controlli isotipici, secondo alle procedure standard di colorazione. </li><li> Raccogliere cellule utilizzando FACS Calibur e analizzare i dati con il software FlowJo. Prima di cellule colorazione, ottimizzare gli anticorpi e titolare concentrazioni con controlli isotipici, normale milza del mouse, e le cellule del midollo osseo. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Questo lavoro è supportato da NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Campana Institute of Health e Nutrition Research Scholar Award in Gut Fisiologia e la salute (AS) e Wright Foundation Pilot Award (AS).

Le tecniche per la generazione di colture primarie sono generalmente simile usando il tessuto murino o umano con tritare e digestione volte adattati per dimensioni del tessuto. La nostra esperienza con il tessuto murino suggerisce che con i metodi sopra descritti costantemente comporta successo creazione di colture primarie. Passaggi critici nel protocollo comprendono la sterilizzazione di attrezzature chirurgiche e seguendo le tecniche sterili standard di coltura di tessuti. L&#39;età dei topi è anche un passaggio cr...

Interazioni epiteliali-stromale sono coinvolti nella regolazione di una varietà di funzioni del tratto gastrointestinale, tra cui la rigenerazione della mucosa, la riparazione, la fibrosi e la carcinogenesi 1,2. Queste interazioni sono state meglio studiate nel piccolo intestino e colon e possono svolgere un ruolo simile in alterazioni della mucosa esofagea 3. Una sottopopolazione di cellule stromali miofibroblasti intestinali e del colon chiamati è stata dimostrata a partecipare a mediare lesioni dei tessuti, l&#39;infiammazione e la riparazione di 4,5. Nel tratto GI distale, queste cellule fusiformi sono adiacenti alla membrana basale all&#39;interfaccia tra l&#39;epitelio e lamina propria e sono definiti come α-SMA e vimentina positivo, pan-citocheratina negative, e debolmente positivo o negativo desmina 5. Lo stroma esofagea non è stato rigorosamente caratterizzato a livello cellulare o molecolare. Il nostro lavoro in esofago murino ha demonstrated α-SMA cellule e vimentina nello stroma esofageo, di tanto in tanto soggiacenti alla epitelio squamoso 6. Interazioni epiteliali-stromale sono stati implicati in alterazioni della mucosa esofagea quali gastro-esofageo danno mediato 6 e esofagite eosinofila 3. Stenosi fibrotiche sono anche una complicanza nota di cellule stromali e lesioni esofagee sono stati implicati nella patogenesi della fibrosi gastrointestinale. L&#39;isolamento di queste cellule aiuterà compiere gli studi necessari per indagare vie di segnalazione squilibrati. Questa presentazione fornisce le tecniche necessarie per stabilire colture primarie di α-SMA positive, miofibroblasti positivi vimentina tale che le lacune esistenti nella conoscenza per quanto riguarda le vie di segnalazione che mediano queste interazioni possono essere affrontati. La tecnica descritta è stata utilizzata con successo dagli autori per stabilire miofibroblasti primari murini colon 7 e further adattato per l&#39;istituzione di murine 6 e cellule stromali esofagee miofibroblasti come umani. Qui descriviamo le condizioni necessarie per realizzare e caratterizzare queste culture stabilite dal mouse o esofago umano prima dell&#39;uso in studi funzionali futuri. Le culture possono essere coltivate e utilizzate fino a 15 passaggi. Isolamento e la creazione di colture primarie tramite le modalità descritte di seguito genera cellule stromali con fenotipo miofibroblasti; α-SMA, vimentina positivo, e debolmente positivo o negativo per la desmina, e citocheratina negativo. Questo fenotipo è distinto dal fenotipo del fibroblasto esofageo che è prevalentemente vimentina positivo, α-SMA negative 3 o α-SMA positive, vimentina fenotipo negativo della muscolaris mucosae 6.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tissue culture reagents</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F42442</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10-652-202-001</td><td></td></tr><tr><td>trypsin/EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Mouse mAB to &amp;alpha;-SMA&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit pAB to vimentin</td><td>abcam</td><td>ab45939</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 conjugated Goat anti Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-225-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>CD31 conjugated to eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>CD90 conjugated to APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0909-41</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V and 7AAD</td><td>BD Pharmigen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block for CD16/CD32</td><td>BD Pharmigen</td><td>2136662</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>5 ml tube</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet and incubators</td><td>Nuaire</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.nuaire.com/products/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.nuaire.com/products/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4-well chamber slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Vacuum-Driven Filter System</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>TRP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flasks</td><td>Corning</td><td>43064</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single tipped Q-Tips</td><td>Kendall</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Metamorph software (Molecular Devices)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSCAlibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of myofibroblasts from mouse and human esophagus

Murine e umane esofagea miofibroblasti sono generati tramite digestione enzimatica. Neonato (8-12 giorni di età) murino esofago viene raccolto, tritata, lavata, e sottoposto a digestione enzimatica con collagenasi e dispasi per 25 min. I campioni di resezione esofagea umani sono spogliati di muscolare propria e avventizia e la mucosa restante viene macinata, e sottoposti a digestione enzimatica con collagenasi e dispasi per un massimo di 6 ore. Cellule in coltura esprimono α-SMA e vimentina e desmina espresso debolmente o per niente. Condizioni di coltura non sono favorevole alla crescita di epiteliale, ematopoietiche o cellule endoteliali. Cultura purezza è ulteriormente confermata da una valutazione citometria a flusso di espressione marcatore superficie cellulare del potenziale contaminante ematopoietiche ed endoteliali. La tecnica descritta è semplice e si traduce nella generazione coerente non hematopoieitc, cellule stromali non endoteliali. Limitazioni di questa tecnica sono inerenti all&#39;uso dicolture primarie di studi di biologia molecolare, cioè, la variabilità inevitabile incontrato tra le culture stabilite in diversi topi e nell&#39;uomo. Colture primarie, tuttavia, sono una riflessione più rappresentativo dello stato in vivo rispetto alle linee cellulari. Questi metodi forniscono anche gli investigatori la possibilità di isolare e cellule stromali cultura di diverse condizioni cliniche e sperimentali, permettendo il confronto tra gruppi. Cellule stromali esofagee caratterizzato possono essere utilizzati anche in studi funzionali in relazione alle interazioni epiteliali-stroma nei disturbi esofagei.

Cellule stromali esofagee isolate mediante digestione meccanica ed enzimatica sono inizialmente placcati e coltivate in 6 pozzetti. Esame di cellule con un microscopio invertito entro ore di placcatura dimostra una sospensione cellulare mista vagamente aderente alla piastra inferiore (Figura 1A). Nel prossimo 24 ore, le cellule fusiformi saldamente aderenti al fondo piatto sono osservate ripresa dalla sospensione cellulare mista (Figura 1B) .Questi cellule germinali coprono l&#39;intera...

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Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  Keck School of Medicine, University of Southern California. We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions. 

Video: Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

Isolamento di CD 90+ fibroblasti / miofibroblasti da umani congelati gastrointestinali campioni


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Bioingegneria

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Biologia

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Medicina

Organoidi esofagei umani e protocolli di coltura dell'interfaccia aria-liquido

Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and microbes. Maintaining the integrity of the epithelial barrier is critical for preventing infections and avoiding inflammation caused by harmless food-derived antigens. This article provides simplified protocols for generating human esophageal organoids and air-liquid interface cultures from patient biopsies to study the epithelial compartment of the esophagus in the context of tissue homeostasis and disease. These protocols have been significant scientific milestones in the last decade, describing three-dimensional organ-like structures from patient-derived primary cells, organoids, and air-liquid interface cultures. They offer the possibility to investigate the function of specific cytokines, growth factors, and signaling pathways in the esophageal epithelium within a three-dimensional framework while maintaining the phenotypic and genetic properties of the donor. Organoids provide information on tissue microarchitecture by assessing the transcriptome and proteome after cytokine stimulation. In contrast, air-liquid interface cultures allow the assessment of the epithelial barrier integrity through transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux measurements. Combining these organoids and air-liquid interface cultures is a powerful tool to advance research in impaired esophageal epithelial barrier conditions.

Autore in primo piano: Indagine sulla fisiopatologia dell'esofagite eosinofila

Here, a protocol for the culture of human esophageal organoids and air-liquid interface culture is provided. Esophageal organoids' air-liquid interface culture can be used to study the impact of cytokines on the esophageal epithelial barrier.

Modelli tridimensionali di coltura cellulare per studiare la barriera epiteliale nell'esofagite eosinofila 

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Immunologia e infezioni

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

Isolamento e cultura della miofibra singola da un modello Murine della distrofia muscolare di Emery-Dreifuss nei primi sviluppi post-Natal

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Isolamento del mesenchima intestinale murino con conseguente alta resa di telociti

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano

Riepilogo

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Isolamento di CD 90+ fibroblasti / miofibroblasti da umani congelati gastrointestinali campioni

Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni

Modelli tridimensionali di coltura cellulare per studiare la barriera epiteliale nell'esofagite eosinofila

Modelli tridimensionali di coltura cellulare per studiare la barriera epiteliale nell'esofagite eosinofila

Modelli tridimensionali di coltura cellulare per studiare la barriera epiteliale nell'esofagite eosinofila

Isolamento e cultura della miofibra singola da un modello Murine della distrofia muscolare di Emery-Dreifuss nei primi sviluppi post-Natal

Isolamento del mesenchima intestinale murino con conseguente alta resa di telociti

Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti