Questo lavoro è stato sostenuto in parte da (1), il Dipartimento della Difesa Breast Cancer Research Program (US Army Medical Research Acquisition Attività) premio # W81XVVH-10-1-0781 a LAL e VE, e (2) la concessione Susan G. Komen Foundation IR122224446 a Lal e VE. Supporto Patologia e di espansione del tessuto è stato gentilmente fornito da Inova Fairfax Dipartimento di Patologia, il dottor Hassan Nayer, il dottor Gita A. Menezes, e il dottor Charles Bechert. Il consenso del paziente e gli appalti del campione è stata sapientemente guidati da Inova Fairfax Hospital coordinatori di ricerca clinica Agrifoglio Gallimore, Heather Huryk, e Emil Kamar.

Tessuto mammario umano è stato raccolto da pazienti arruolati in uno studio di ricerca, con il consenso informato scritto, in seguito Dipartimento della Difesa, George Mason University, e protocolli approvati di Inova Health System Institutional Review Board. 1. Preparare nutrienti Rich Media con fattori di crescita e antibiotici <ol><li> Preparare soluzioni di riserva di insulina, fattore di crescita epidermico (EGF), solfato di streptomicina e gentamicina solfato. <ol><li> Ricostituire insulina in acqua filtrata sterile a una concentrazione finale di 10 mg / ml. Aspirare 10 ml di tipo 1 acqua distillata in una sterile 10 ml siringa monouso. Collegare un filtro da 0,22 micron polietersulfone alla siringa. Versare l&#39;acqua filtrata sterile, in un tubo da 15 ml sterile. </li><li> Aggiungere 10 ml di acqua filtrata sterile per un flaconcino da 100 mg di insulina. Mescolare il contenuto brevemente su un vortex. Conservare il flaconcino dell&#39;insulina sul ghiaccio. Dispensare 450 ml di insulina magazzino Soluzione in etichetta, microprovette sterili e conservare a -20 ° C. L&#39;insulina soluzione madre è stabile fino alla data di scadenza sul flacone. </li><li> Preparare soluzione madre del fattore di crescita epidermico (EGF): Aggiungere 500 ml di acqua sterile a 500 mg FEG (azione 1 mg / mL). Mescolare il contenuto brevemente su un vortex. Conservare il flaconcino FEG sul ghiaccio. <ol><li> Preparare una soluzione madre di lavoro del FEG: Aggiungere 100 ml di soluzione madre FEG a 900 microlitri terreno nutritivo (brodo di lavoro sarà di 0,1 mg / mL). Mescolare il contenuto brevemente su un vortex. Dispensare 50 ml di soluzione di FEG di lavoro stock in etichetta, microprovette sterili e conservare a -80 ° C. NOTA: soluzione madre EGF (1 mg / mL) è stabile per 1 anno a -80 ° C; lavora soluzione madre (0.1 mg / mL) è stabile per 2 mesi a -80 ° C. </li></ol></li><li> Pesare 40 mg di solfato di streptomicina su una bilancia analitica. Posizionare il int streptomicina solfatooa sterili tubo da 15 ml. Aggiungere 4 ml di terreno di coltura. Mescolare il contenuto brevemente su un vortex. La soluzione deve essere leggermente rosa. Conservare a 4 ° C al riparo dalla luce. Soluzione di solfato di streptomicina è stabile per 7 giorni. </li><li> Pesare 20 mg di solfato di gentamicina su una bilancia analitica. Posizionare il solfato di gentamicina in un tubo da 15 ml sterile. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura. Mescolare il contenuto brevemente su un vortex. La soluzione deve essere di colore giallo. Conservare a 4 ° C al riparo dalla luce. Soluzione di solfato di gentamicina è stabile per 7 giorni. </li></ol></li><li> Preparare due 200 ml lotti di terreno nutriente addizionato con EGF umano ricombinante (10 ng / ml conc def.), Insulina (10 mcg / ml conc def.), Solfato di streptomicina (100 mcg / ml conc def.) E solfato di gentamicina (20 ug / ml conc def.). <ol><li> Aggiungere mezzo 200 ml di nutrienti una beuta per filtrazione a vuoto equipaggiato con una beuta per filtrazione 0,2 micron polietersulfone e ricevere flacone 250 ml. Aggiungere 20 &amp;# 181; l stock di lavoro FEG, 200 ml brodo di insulina, 2 ml di brodo di streptomicina solfato, e 400 microlitri magazzino gentamicina solfato ai 200 ml di terreno di coltura. Attaccare beuta per filtrazione a vuoto. Filtrare il mezzo. Eliminare il filtro e l&#39;etichetta del pallone come &quot;terreno ricco di sostanze nutritive&quot;. Conservare a 4 ° C per un massimo di 14 giorni. </li></ol></li></ol> 2. Acquisizione dei tessuti e di incassi <ol><li> In sala operatoria, mantenere una tecnica sterile dopo procurare il tessuto del seno. Posizionare il tessuto del seno in un vassoio sterile e coprire il vassoio con pellicola trasparente sterile. <ol><li> Trasportare il tessuto nel vassoio coperto di Radiologia / patologia come richiesto dal vostro istituto. Non aprire il cassetto. Tempi di trasporto variano all&#39;interno delle istituzioni. Tessuto può rimanere vitale in questo vassoio coperto a temperatura ambiente per un massimo di 45 minuti dopo l&#39;escissione. Tuttavia, rapida trasformazione del tessuto in terreno ricco di sostanze nutritive offre le condizioni ottimali per la successiva cultura organoide. </li></ol></li><li> Dissezione dei tessuti lordo per identificare le aree di carcinoma duttale in situ all&#39;interno del tessuto del seno: Utilizzare guanti sterili, lame, bisturi, tessuto coloranti marcatura e aceto durante la dissezione dei tessuti per mantenere la sterilità dei tessuti. <ol><li> Pulire l&#39;area di lavoro con il 70% di etanolo o 1% di candeggina. Aprire i guanti sterili e posizionare l&#39;involucro guanto sul piano di lavoro. Posizionare l&#39;interno del guanto sterile involucro a faccia in su. Indossare i guanti sterili. <ol><li> Pulire la superficie del contenitore del campione con il 70% di etanolo. Rimuovere la pellicola trasparente dal contenitore del campione del tessuto e posizionare il campione sulla confezione guanto. </li></ol></li><li> Immergere due tamponi di cotone con punta nella tintura dei tessuti marcatura. Applicare il colorante alla superficie del tessuto facendo rotolare i tamponi sulla superficie del tessuto. NOTA: Ogni reparto di patologia ha un protocollo di orientamento colore della tintura / tessuto standardizzato. Tissue è etichettato con la tintura per orientare il tessuto in relazione alla sua posizione nel paziente. Il colorante viene cancellato odipinto sul tessuto. Non versare il colorante sul tessuto. Versare il colorante può causare il colorante per eseguire / goccia a goccia in fessure del tessuto confondendo in tal modo l&#39;orientamento dei margini chirurgici. Orientamento tessuto fornisce al chirurgo e patologo con reperi anatomici ad a) descrive il campione di tessuto, e b) determinare la posizione dei margini chirurgici in relazione al tumore. </li><li> Versare aceto bianco distillato (5% di acido acetico) su garze sterili. Asciugare il tessuto tinta con la garza imbevuta di aceto. Eliminare la garza. L&#39;aceto è usato per fissare la marcatura tinture dei tessuti. </li><li> Tagliare il tessuto mammario a fette verticali spesse circa 5 mm. Non tagliare tutto il percorso attraverso il tessuto (Figura 2). Osservare / palpare il tessuto per le aree di calcificazione. Identificare le lesioni DCIS dalla loro impresa caratteristico, pallido aspetto circondato da rossastro, confini gommose che si sentono grintoso (a causa di spicole di calcio). NOTA: In alcuni casi, comedo (brufolo-like) aree possono esserevisto come puntini bianchi, che rappresentano il materiale necrotico dal grande diametro lesioni DCIS. </li><li> Tagliare le aree di carcinoma duttale in situ / tessuto mammario calcificata, tra cui una piccola quantità di tessuto mammario circostante. Posizionare il tessuto del seno in una provetta sterile da 50 ml contenente 20-30 ml di terreno ricco di sostanze nutritive preparato al punto 1. <ol><li> Mescolare il tessuto e medie capovolgendo delicatamente il tubo più volte. Eliminare il medio e aggiungere mezzo fresco. Posizionare il tubo contenente il tessuto e medio in un contenitore coibentato e trasportare il tessuto al laboratorio coltura tissutale. </li></ol></li></ol></li></ol> Cultura 3. Tessuto <ol><li> Lavorando in una cappa di sicurezza biologica, versare il tessuto e una piccola quantità del mezzo nutritivo in una piastra di Petri sterile. Usando un bisturi sterile tagliato via ed eliminare il tessuto fibroso. Tagliare il tessuto del seno in pezzi (organoidi) circa 3 mm 2 (Figura 1C-D). Prova a tagliare il tessuto in modo che ciascun organooid contiene almeno un segmento di condotto distinguibile con stroma circostante. </li><li> Aprire il coperchio del pallone di coltura tissutale. Con una pinzetta sterili o pinze, inserire i organoidi nel pallone. Chiudere il coperchio. Gettare la capsula di Petri. </li><li> Aggiungere 11 ml di terreno ricco di nutrienti privo di siero (preparato al punto 1) al pallone di coltura tissutale. Chiudere il flacone e agitare il pallone in modo che i organoidi e le medie sono distribuiti uniformemente su tutta la superficie pallone (Figura 1E-F). </li><li> Incubare il matraccio a 37 ° C in un umidificata 5,0% di CO 2 ambiente per 2 giorni. Non spostare il pallone durante questo periodo. </li><li> Il giorno 2 dopo incubazione, togliere il pallone dal termostato per controllare la potenziale contaminazione batterica / fungina. Evitare improvvisi, movimenti bruschi, o vorticoso del pallone. Porre il pallone su una fase microscopio invertito. <ol><li> Osservare il mezzo per batteri, lieviti e / o funghi. Se si nota nessuna contaminazione, restituire il pallone incubatore per un addgiorno transi-. Se si nota la contaminazione, scartare il matraccio con il contenuto in un apposito contenitore. </li></ol></li><li> Il giorno 3 dopo incubazione, sostituire il terreno condizionato con terreno fresco. <ol><li> Porre 11 ml di terreno in una provetta sterile a 37 ° C per 20-30 min. Togliere il pallone di coltura di tessuto dal termostato. Senza scomodare i organoidi, rimuovere ed eliminare il supporto nel pallone con una pipetta sierologica sterile. </li><li> Utilizzando una nuova sierologica pipetta sterile, aggiungere 11 ml di mezzo fresco preriscaldata. Ruotare molto delicatamente il pallone di distribuire il mezzo attraverso la superficie matraccio. </li><li> Incubare il matraccio a 37 ° C in un umidificata 5,0% di CO 2 nell&#39;atmosfera. </li></ol></li></ol> 4. Manutenzione del Fondata colonie di cellule organoide / epiteliali <ol><li> Preparare terreno fresco ogni 2 settimane e sostituire il supporto nel pallone di coltura tissutale 3 volte alla settimana. <ol><li> Porre 11 ml di terreno in un contenitore sterile a 37° C per 20-30 min. Togliere la beuta dal termostato. Usando una pipetta sierologica sterili, rimuovere ed eliminare il medium condizionato dal pallone, facendo attenzione a non disturbare i organoidi. </li><li> Utilizzando una nuova sierologica pipetta sterile, aggiungere 11 ml di mezzo fresco preriscaldata. Ruotare molto delicatamente il pallone di distribuire il mezzo attraverso la superficie matraccio. Incubare il matraccio a 37 ° C in un umidificata 5,0% di CO 2 nell&#39;atmosfera. </li></ol></li><li> Dopo 10 - 14 giorni in coltura, rimuovere tutti i pezzi di tessuto nel pallone di coltura che non sono aderenti. <ol><li> Cellule Periodicamente raccolta e / o organoidi dal pallone per la propagazione in nuove fiasche di coltura, per il trapianto di xenotrapianto, o per fenotipica e / o l&#39;analisi molecolare. </li><li> Togliere il pallone di coltura di tessuto dal termostato. Spruzzare il pallone con il 70% di etanolo. Rimuovere l&#39;eccesso di etanolo sul pallone con un tovagliolo di carta pulito che è stato spruzzato con il 70% di etanolo. </li><li> Propagazione organoide: &lt;ol&gt; <li> Aprire il coperchio della muffola e posizionare il coperchio rivolto verso l&#39;alto nella cappa di sicurezza biologica. Sotto la visualizzazione microscopica, individuare il organoide (s) per essere raccolto. Utilizzare le pinzette sterili o pinze per pick-up di un organoide. </li><li> Per propagare la organoide in un nuovo pallone di coltura, posizionare il organoide nel nuovo fiasco. Aggiungere 11 ml di fresco, di medio caldo. Incubare a 37 ° C, in un umidificata al 5% di CO 2 nell&#39;atmosfera come descritto ai punti 3.3 - 3.6.3. Sostituire il terreno di coltura cellulare in coltura tissutale pallone a tre volte alla settimana. </li></ol></li><li> Raccolta delle cellule: <ol><li> Sotto vixualization microscopico diretto, raschiare delicatamente e le cellule aspirare e mammospheres con una pipetta 1000 ml con puntali per pipette sterili monouso. Aspirare le cellule e mezzo circostante. Erogare il cellule / medio in una provetta sterile. </li></ol></li><li> Spin le cellule brevemente un mini-centrifugare a 12.100 xg per 5 sec. Rimuovere e gettare il medium. &lt;ol&gt; <li> Per l&#39;analisi del DNA, congelare immediatamente il pellet di cellule in ghiaccio secco, in un piccolo volume di terreno (10 ml), con una lunga conservazione a -80 ° C. </li><li> Per l&#39;analisi proteomica, lisare le cellule in 10 ml di 8 M urea per la spettrometria di massa o 2x SDS tampone Tris-glicina per blotting / inversione di microarrays della proteina di fase occidentali. In alternativa, far girare le cellule in una citocentrifuga per fare strisci cellulari per l&#39;analisi immunoistochimica. </li></ol></li><li> Dopo la raccolta le cellule da un pallone, rimuovere ed eliminare il supporto rimanente. Aggiungere 11 ml di caldo, terreno ricco di nutrienti freschi. Incubare il matraccio a 37 ° C, in un umidificata al 5% di CO 2 nell&#39;atmosfera. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Shaughnessy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+intraepithelial+neoplasia:+an+important+target+for+accelerated+new+agent+development.">Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development.</a> Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+precursor+cells+pre-exist+in+human+breast+DCIS+and+require+autophagy+for+survival.">Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival.</a> PLoS One. 5 (4), (2010).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Farnie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+technique+for+primary+ductal+carcinoma+in+situ:+role+of+Notch+and+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+pathways.">Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways.</a> J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).</li><li>Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+collagen+requirements+for+attachment+and+growth+of+mammary+epithelium.">Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium.</a> Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).</li><li>Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+malignant+nature+of+human+ductal+carcinoma+in+situ.">What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ.</a> Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin+1+and+autophagy+are+required+for+the+tumorigenicity+of+breast+cancer+stem-like/progenitor+cells.">Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells.</a> Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).</li><li>Simon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+glycoprotein+is+a+member+of+a+family+of+epithelial+cell+surface+antigens+homologous+to+nidogen,+a+matrix+adhesion+protein.">Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein.</a> PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).</li><li>Ma, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+human+breast+cancer+progression.">Gene expression profiles of human breast cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).</li><li>Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+prognostic+index+for+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.+Are+we+there+yet.">Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet.</a> Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).</li><li>Sgroi, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+breast+cancer.">Preinvasive breast cancer.</a> Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).</li><li>Asch, H. L., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+keratin+expression+in+mouse+mammary+hyperplastic+alveolar+nodules+and+adenocarcinomas.">Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas.</a> Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).</li><li>LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+microenvironments+and+mammary+stem+cells.">Of microenvironments and mammary stem cells.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).</li><li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity.">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+picture+of+the+mouse+mammary+stem+cell.">The emerging picture of the mouse mammary stem cell.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cap+associated+focal+adhesions+and+their+distinct+role+in+cellular+mechanosensing.">Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing.</a> Sci Rep. 2, 555 (2012).</li><li>Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attacking+breast+cancer+at+the+preinvasion+stage+by+targeting+autophagy.">Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy.</a> Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).</li><li>D'amonte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+behavior+is+programmed+in+the+precancer+stem+cell.">Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il sistema di coltura qui descritto costituisce un nuovo modello per la generazione che vivono le cellule del seno neoplastiche pre-invasive per gli studi di ricerca di base e traslazionale. In passato, la progressione del cancro al seno pre-maligne è tipicamente stata studiata utilizzando tre metodi differenti. Il primo metodo è istopatologica e analisi genetica di microdissezionate congelati o fissi campioni umani 12-14. Il secondo metodo utilizza modelli murini che contengono noduli alveolari iperplastic...

Proliferazione delle cellule epiteliali entro i confini di dotti mammari e alveoli (carcinoma duttale in situ) è riconosciuto come un precursore obbligato a duttale invasivo e carcinoma mammario lobulare. Tuttavia, i meccanismi molecolari e dinamica delle popolazioni di cellule che consentono la progressione a carcinoma invasivo sono poco conosciuti. Chiarire i meccanismi di sopravvivenza utilizzate da cellule di carcinoma mammario pre-invasive, o qualsiasi tumore pre-invasivo, può rivelare strategie terapeutiche per l&#39;uccisione, o addirittura prevenire, neoplasie pre-invasive 1. Tuttavia, i metodi a basso costo per semplici funzionalmente studiano lesioni pre-invasive umani sono mancati. Sebbene monostrato coltura in vitro di linee cellulari trasformate è un metodo di laboratorio stabilita, il fenotipo e il genotipo di queste linee cellulari immortalizzate riesce ricapitolare lo stato molecolare delle cellule tumorali umane primarie 2. Inoltre, anche la linea cellulare MCF-10A non oncogeno, che Recapitulates 3-D architettura della ghiandola mammaria, non riesce a rappresentare adeguatamente il fenotipo funzionale e le caratteristiche molecolari di pre-invasiva della lesione al seno di un singolo paziente 3,4. Per determinare se le cellule staminali neoplastiche, come in grado di invasione esistevano all&#39;interno del carcinoma duttale in situ (DCIS) popolazione di cellule, abbiamo sviluppato una metodologia per la raccolta e la coltura di tessuto mammario umano sterili al momento dell&#39;intervento chirurgico (Figura 1) 5. Il nostro ex vivo seno sistema di coltura organoide non si basa sulla rottura enzimatica dei tessuti, estratto di membrana basale della matrice, o fibroblasti esaurimento, per isolare e propagare le cellule che formano mammosphere dal fresco duttale mammario umano carcinoma tessuto 6-8. Il nuovo sistema si basa sul principio della cella di flusso / migrazione 5. I dotti mammari discernibili e stroma circostante vengono immersi in un volume minimo di mezzo privo di siero nutriente (solo postanough per coprire i frammenti cassone) per massimizzare lo scambio di gas, con la superficie di taglio del condotto esposta al mezzo di coltura, ma in nessun orientamento specifico nel pallone (Figura 1E-F). Questo sistema di coltura consente alle cellule di migrare dal condotto e nella / sulla stroma e la cultura matraccio autologo. Il mezzo nutriente, integrato solo con Epidermal Growth Factor (EGF), l&#39;insulina, e gli antibiotici, sostiene la crescita di popolazioni cellulari miste provenienti dalla organoide. Il pallone di coltura tissutale ha un coperchio richiudibile rimovibile che permette ai organoidi e / o cellule per essere raccolti senza interrompere l&#39;intero boccetta adiacente organoidi, pur mantenendo un ambiente umidificato sterile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ethanol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A405-P</td>
			<td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water, sterile filtered</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cc plastic disposable syringe, sterile</td>
			<td style="width:187px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2&#181;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">194-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">15ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin, human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11376497001</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GF144</td>
			<td>100&#181;g/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S1567</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G19114</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration flask and filter top, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>0.22&#181;m PES membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>4489</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4488</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:353px;">Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td>
			<td style="width:187px;">CDI</td>
			<td style="width:119px;">MD2000</td>
			<td style="width:365px;">after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cotton tipped applicators, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>23-400-115</td>
			<td>single use only</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Gauze pads, 10x10cm, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td>
			<td style="width:187px;">Samco</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Vinegar, white distilled</td>
			<td style="width:187px;">household use</td>
			<td></td>
			<td style="width:365px;">5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">#10 scalpels, sterile, disposable&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>31-200-32&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">petri dish, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">TPP 115cm2 flask, with removable lid</td>
			<td style="width:187px;">MidSci</td>
			<td style="width:119px;">90652</td>
			<td>screw cap with filter</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:353px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>5% CO2, 37 oC, humidified chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">inverted light microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olypmus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">8M urea</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-500</td>
			<td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2X SDS tris-glycine buffer</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>optional, for preparing cell smears</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

Breast carcinoma duttale in situ (DCIS), per definizione, è la proliferazione delle cellule epiteliali neoplastiche entro i confini del condotto del seno, senza violare la membrana basale collagene. Mentre carcinoma duttale in situ è ​​un precursore non obbligato a tumori al seno invasivi, i meccanismi molecolari e le popolazioni di cellule che permettono la progressione a carcinoma invasivo non sono completamente noti. Per determinare se le cellule progenitrici capaci di invasione esistevano all&#39;interno della popolazione di cellule carcinoma duttale in situ, abbiamo sviluppato una metodologia per la raccolta e la coltura di tessuto mammario umano sterile al momento della chirurgia, senza interruzione enzimatica del tessuto. Tessuto del seno sterile contenente segmenti duttali è raccolto da tessuto mammario asportato chirurgicamente dopo esame patologico di routine. Tessuto contenente DCIS è posto in ricca di nutrienti, antibiotici contenenti, mezzo privo di siero, e trasportato al laboratorio di coltura di tessuti. Il tessuto del seno è più dissected per isolare le zone calcificate. Molteplici pezzi di tessuto mammario (organoidi) sono posti in un volume minimo di mezzo privo di siero in un pallone con un coperchio amovibile e coltivate in un incubatore umidificato CO 2. Popolazioni di cellule epiteliali e fibroblasti emergono dal organoide dopo 10 - 14 giorni. Mammospheres spontaneo formarsi intorno e sul monostrato di cellule epiteliali. Specifiche popolazioni cellulari possono essere raccolte direttamente dal pallone senza interrompere le cellule vicine. Il nostro sistema di coltura di tessuti non-enzimatica rivela affidabile citogeneticamente anormali, invasive cellule progenitrici di nuove lesioni DCIS umani.

Flusso di lavoro per l&#39;approvvigionamento e la coltura sterile carcinoma duttale mammario in situ dei tessuti Sterilità tessuto mammario viene mantenuta dalla sala operatoria al laboratorio di colture cellulari attraverso piccole modifiche in tipico flusso di lavoro patologia ospedale (Figura 1). Tessuto viene trasportato in un contenitore sterile con un coperchio film plastico che consente la valutazione radiologica pur mantenendo la sterilità dei tessuti. Proce...

Watch this Scientific Journal Video about Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres at JoVE.com

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Coltura cellulare primaria utilizzando organoidi tessuto intatto fornisce un sistema modello che simula il microambiente multi-cellulare in vivo. Abbiamo sviluppato un primo modello di coltura di tessuti epitelio mammario senza siero che perpetua linee di colture cellulari miste e mostre differenziati morfologia, senza interruzione del tessuto enzimatico. Organoidi seno rimangono vitali per&gt; 6 mesi.

Non enzimatica, siero-libero Tissue Culture delle lesioni mammarie pre-invasive per la generazione spontanea di mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Views.  George Mason University.  Coltura cellulare primaria utilizzando organoidi tessuto intatto fornisce un sistema modello che simula il microambiente multi-cellulare in vivo. Abbiamo sviluppato un primo modello di coltura di tessuti epitelio mammario senza siero che perpetua linee di colture cellulari miste e mostre differenziati morfologia, senza interruzione del tessuto enzimatico. Organoidi seno rimangono vitali per> 6 mesi. 

Video: Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Ricerca

Biologia

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

Generazione di Single-Cell Sospensioni dal tessuto neurale del mouse

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

Preparazione del pool lisato piastrinico umani (pHPL) come supplemento efficiente per animali siero-Free Culture sulle cellule staminali umane

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Electrospinning Ponteggi polimeri fibrosi per l&#39;ingegneria tissutale e colture cellulari

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

A lungo termine Cultura di campioni umani cancro al seno e la loro analisi utilizzando la tomografia ottica di proiezione

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca and, in particular, of the granulosa cell layer profoundly change their morphological, physiological, and molecular characteristics and form the progesterone-producing corpus luteum that is responsible for maintaining pregnancy. Cell culture models are essential tools to study the underlying regulatory mechanisms involved in the folliculo-luteal transformation. The presented protocol focuses on the isolation procedure and cryopreservation of bovine GC from small- to medium-sized follicles (&#60; 6 mm). With this technique, a nearly pure population of GC can be obtained. The cryopreservation procedure greatly facilitates time management of the cell culture work independent of a direct primary tissue (ovaries) supply. This protocol describes a serum-free cell culture model that mimics the estradiol-active status of bovine GC. Important conditions that are essential for a successful steroid-active cell culture are discussed throughout the protocol. It is demonstrated that increasing the plating density of the cells induces a specific response as indicated by an altered gene expression profile and hormone production. Furthermore, this model provides a basis for further studies on GC differentiation and other applications.

A long-term culture model of bovine granulosa cells under serum-free conditions is described. This model allows researchers to study the effects of diverse factors and conditions as different plating densities on the characteristics of estrogen-producing bovine granulosa cells.

Un modello di coltura del tessuto della produzione di estrogeno primario bovina Granulosa Cells

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Raccolta di tessuti di pipistrelli per -Omics Analyses e Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated clearance. Many clinically relevant defects in the mucociliary epithelium are inferred as they occur deep within the body. Here, we introduce a tractable 3D model for mucociliary epithelium generated from multipotent progenitors that were microsurgically isolated from Xenopus laevis embryos. The mucociliary epithelial organoids are covered with newly generated epithelium from deep ectoderm cells and later decorated with distinct patterned multiciliated cells, secretory cells, and mucus-producing goblet cells that are indistinguishable from the native epidermis within 24 h. The full sequences of dynamic cell transitions from mesenchymal to epithelial that emerge on the apical surface of organoids can be tracked by high-resolution live imaging. These in vitro cultured, self-organizing mucociliary epithelial organoids offer distinct advantages in studying the biology of mucociliary epithelium with high-efficiency in generation, defined culture conditions, control over number and size, and direct access for live imaging during the regeneration of the differentiated epithelium.

We describe a simple protocol to develop mucociliary epithelial organoids from deep ectoderm cells isolated from Xenopus laevis embryos. The multipotent progenitors regenerate epithelial goblet cell precursors and allow live tracking of the initiation and progression of the cell transitions on the surface of organoids.

Organoidi epiteliali mucociliari di cellule embrionali xenopus: generazione, coltura e imaging dal vivo ad alta risoluzione

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Coltura tissutale della corteccia ovarica bovina

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...