Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da CIHR (MOP394808) e una sedia di ricerca del Canada a CMCEWO è stato il destinatario di una borsa di studio post-laurea da NSERC.

Nota: Questo protocollo è ampiamente compatibile con vari modelli monostrato placcato cellule / tessuti cultura, i regimi di trattamento di droga, e gli obiettivi in ​​materia di etichettatura. Così in uso, molti parametri specifici variano in base al design sperimentale. Qui, i riferimenti a questi parametri definiti dall&#39;utente sono generici. Esempio condizioni, usati per ottenere i risultati rappresentativi, sono riportate in corsivo. 1. Soluzioni <ol><li> Preparare tampone di lavaggio mescolando 0.1M Tris-Buffered ipertonica (300 mm) Saline e 0,05% polisorbato 20; pH 7.4 a RT. </li><li> Preparare tampone di bloccaggio. Per 0,05 M Tris-Buffered ipertonica (300 mm) Saline aggiungere 0,05% polisorbato 20, 3% albumina sierica bovina (BSA) e 0,1% pesce freddo pelle gelatina e regolare il pH a 7,4 a temperatura ambiente. </li><li> Preparare diluente aggiungendo 0,05% polisorbato 20, 1% di BSA, 0,1% pesce freddo pelle gelatina di 0,05 M Tris-Buffered ipertonica (300 mm) Saline e regolare il pH a 7,4 a 4 ° C. Nota: Il pH del buffer Tris è dipendente dalla temperatura. Cioè, un cambiamento di temperatura cambierà il pH della soluzione. Per coerenza, questi buffer devono essere sempre pH regolato alla temperatura alla quale saranno utilizzati. </li></ol> Culture 2. Cella Nota: i protocolli di colture cellulari adeguate variano in base al tipo di cellule (s) utilizzato. Tali procedure devono essere ottimizzate separatamente. Dettagliate metodologie di coltura cellulare sono facilmente disponibili, di cui 16. Una procedura simile è stato utilizzato per ottenere i risultati rappresentativi, con le notevoli differenze: <ol><li> Cultura gangli spinali neuroni di animali adulti come descritto 12. Utilizzare crescita media degli adulti-neurone a coltura le cellule. Ridurre la densità delle cellule gliali da preplating, piuttosto che il glutammato. Ciò si traduce in una cultura neurone gliali mista coltivate su 12-rotonde coprioggetto di vetro con almeno 30-60 per piastra neuroni e cellule gliali accompagnamento diventato approximately 40% di confluenza. Va osservato che i neuroni in coltura primaria non replicare e sarà spinto fuori della piastra da glia co-coltura se la glia possono crescere eccessivamente. Per evitare di compromettere i neuroni, la riduzione fisica dei numeri gliali è preferibile metodi farmacologici chimici /. Nota: Ai fini del presente protocollo, si assume che le cellule di interesse sono coltivate a loro sperimentalmente desiderato Stato e monostrato placcato. Troviamo che placcatura su 12 per tutto l&#39;coprioggetto di vetro in 24 pozzetti per essere più conveniente. Tutti i volumi e le procedure descritte sono adatte per un vetrino in un pozzetto di una piastra ben 24. </li></ol> 3. Il trattamento con farmaci delle cellule in coltura Nota: Multiple sequenziale, o sovrapposte, trattamenti farmacologici sono possibili. I farmaci, le dosi / concentrazioni e durate di esposizione utilizzata dipenderà l&#39;esperimento specifica. <ol><li> Rimuovere il mezzo di crescita originale 16 </sup&gt; e sostituirlo con medium contenente il farmaco (s) di interesse alla concentrazione (s) prescelto. In questo caso, utilizzare 10 pM di Morphine solubilizzati in soluzione fisiologica salina oppure usa come controllo. Nota: È importante che ciascun replicato indipendente (generalmente una singola coltura in piastra a 24 pozzetti) contengono la stessa condizione di controllo comune. Questo permetterà la normalizzazione dei dati attraverso repliche, che corregge la variabilità inter-trial. </li><li> Incubare le cellule in condizioni di crescita originarie 16 per 48 ore. </li><li> Per trattamenti farmacologici successivi, ripetere i punti 3.1 e 3.2 con deltorfina 1 micron, SNC80 1 micron, o il veicolo e incubare per 60 minuti 12. Solubilizzare deltorfina II in acqua e solubilizzare SNC80 a 10 mM in 40 mM HCl e ultrasuoni, diluito a 1 mM in acqua. Nota: Questo protocollo assume il farmaco (s) sono stati solubilizzati in modo che essi possono essere sciolti alla concentrazione (s) desiderata nel mezzo di crescita prescelto. Procedure appropriate pertale solubilizzazione varierà a seconda del farmaco in questione e deve essere ottimizzato separatamente. </li><li> Lavare le cellule delicatamente, tre volte, con ~ 1 ml di tampone di lavaggio per lavaggio. Eseguire ogni lavaggio aspirando delicatamente il liquido dal pozzetto, poi prontamente e dolcemente, riempimento pozzo con soluzione fresca, come desiderato (in questo caso con tampone di lavaggio). </li></ol> 4. Fissazione e Immunocitochimica Nota: Gli obiettivi specifici in materia di etichettatura variano da esperimento. Nel nostro uso, abbiamo etichettato recettori oppioidi delta (DOR) e Rab5, Rab 11, e LAMP1, come discusso. Gli anticorpi specifici utilizzati dipenderà l&#39;esperimento specifico. Condizioni ottimali di etichettatura dipendono l&#39;anticorpo specifico (i) utilizzati. Una discussione molto più ampia di questo argomento è al di sotto. <ol><li> Fissare le cellule mediante immersione in ~ 300 microlitri 4% paraformaldeide in 0,1 M tampone fosfato per 10 min a 37 ° C. Nota: E &#39;importante che il para 4%formaldeide essere preparata a causa della autofluorescenza causati dall&#39;uso di paraformaldeide precedentemente congelati. </li><li> Lavare le cellule delicatamente, 3 volte, con ~ 1 ml di tampone di lavaggio per lavaggio, come descritto al punto 3.3. </li><li> Incubare le cellule in 300 microlitri tampone di bloccaggio per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Incubare le cellule con anticorpi primari in 300 ml di diluente per 48 ore a 4 ° C. Nel nostro uso, anticorpi primari contro DOR (coniglio anti-DOR) e uno di: Rab5 (topo anti-Rab5), Rab 11 (topo anti-Rab11), e LAMP1 (capra anti-LAMP1). </li><li> Lavare le cellule delicatamente, tre volte, con ~ 1 ml di tampone di lavaggio per lavaggio, come descritto al punto 3.3. </li><li> Incubare le cellule con anticorpi secondari coniugati con differenti fluorofori (vedere discussione seguente) in 300 ml di diluente per 1 ora a RT. In questo, e tutti i passaggi successivi, proteggere le cellule dalla luce. Per ottenere i risultati rappresentativi, utilizzare verde emettitori anti-coniglio fluoroforo coniugato e either un fluoroforo-coniugato anti-topo rosso luminescente o rosso-emitting fluoroforo coniugato anti-capra. </li><li> Lavare le cellule delicatamente, 3 volte, con ~ 1 ml di tampone di lavaggio per lavaggio, come descritto al punto 3.3. </li><li> Togliere i coprioggetti 12-round da 24 pozzetti lasciando ~ 1 ml di tampone di lavaggio in ogni pozzetto, tenendo la piastra a ~ 45 °, e leva il vetrino fuori del pavimento pozzetto utilizzando una pinza sottile. Il coprioggetto arriverà a riposo contro il muro pozzo, da dove può essere facilmente rimosso con le pinze. </li><li> Montare il coprioggetto, cell-side-down, su vetrini da microscopio con l&#39;anti-fading mezzo di montaggio. </li></ol> 5. Impostazioni microscopio <ol><li> Utilizzando un obiettivo ad alto ingrandimento (100X), prima di individuare una cella rappresentante di essere ripreso con epifluorescenza. </li><li> Configurare le impostazioni di cattura dell&#39;immagine per registrare le immagini TIFF non compresso a 8-bit di ciascun canale con etichetta (per il rilevamento di ogni fluoroforo utilizzato ad esempio, 488 nm e 594 nm), per ogni immagine sequenzialmente canale (o per riga o telaio), e da 4 a 6 scansioni medi per l&#39;immagine finale. Risoluzione dell&#39;immagine ottimale sarà specifico per microscopio, ma 1024 x 1024 produce in genere buoni risultati. </li><li> Passare al percorso confocale e concentrarsi ad un piano z attraverso il centro della cella. </li><li> Ottimizzare pinhole (tipicamente 1 unità Airy), potenza del laser, e tensione del tubo fotomoltiplicatore (guadagno) e offset per ciascun canale. Salvare / registrare queste impostazioni. Utilizzare le stesse impostazioni del microscopio per l&#39;imaging tutte le cellule etichettate per ogni data coppia di destinazione nella stessa replica. Nota: Questo processo di solito provoca photobleaching sufficiente che questa cellula non dovrebbe essere ripreso per l&#39;analisi. </li></ol> 6. Imaging <ol><li> Utilizzando un obiettivo alto ingrandimento (es 100X), prima localizzare una cella da acquisire con epifluorescenza. </li><li> Passare al percorso confocale e concentrarsi ad un piano z attraverso il centro della cella. IOf disponibili, utilizzare software di zoom / coltura per limitare l&#39;area di scansione per la cella di interesse. </li><li> Catturare immagini per ogni canale con etichetta con le impostazioni stabilite in precedenza. Ripetere i passaggi 6,1-6,3 per immagine 15 o più cellule per condizione per replica per assicurare un campione sufficiente. </li></ol> 7. Colocalizzazione Analisi <ol><li> Aprire la coppia di immagini (ad esempio, &#39;verde&#39; e &#39;red&#39;) di una cella in ImageJ. Utilizzare le Immagini&gt; Colore&gt; Unisci canali ... comando per generare un&#39;immagine RGB. </li><li> Disegna una selezione attorno alla cella di interesse. Utilizzare il ImageJ plugin &quot;PSC Colocalizzazione&quot; (11, disponibile da https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) per quantificare colocalization degli obiettivi nella cella selezionata. </li><li> Registrare la misura colocalizzazione desiderata (in genere di Pearson r 17). Ripetere i passaggi 7,1-7,3 per ogni cella ripreso. </li></ol&gt; 8. Normalizzazione dei dati <ol><li> Calcolare la media dei valori rilevati colocalizzazione delle condizioni di controllo comuni di ciascuna replica di ciascuna condizione etichettatura. Nota: per esempio, la media dei valori colocalizzazione di neuroni nel &quot;veicolo di 48 ore, 60 minuti veicolo&quot; condizione di droga in ciascuno dei 3 repliche indipendenti in ciascuna delle 3 condizioni di etichettatura (recettore e ciascuno dei 3 scomparti). </li><li> Moltiplicare i mezzi di (-1) per ottenere l&#39;offset per ogni replica in tutte le condizioni di etichettatura. Aggiungere l&#39;offset per ogni replica in ogni condizione di etichettatura per ogni valore colocalizzazione in quella replica. Nota: Questo normalizzare i dati in modo che la misura colocalizzazione media per la condizione di controllo comune è 0 in ogni copia di ogni condizione di etichettatura. </li><li> Pool i dati di tutte le repliche di ogni condizione di etichettatura. Nota: le modifiche in colocalization ora possono essere analizzati attraverso repliche. Anale statisticaYsis dipenderà disegno sperimentale, ma in genere comporta analisi della varianza (ANOVA) seguita da opportune prove post-hoc (ad esempio, Tukey). Per le risorse statistici, si veda ad esempio, 18. </li></ol>

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Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Abbiamo ottimizzato questo protocollo per l&#39;analisi delle colture primarie di neuroni adulti gangli delle radici dorsali (neuroni sensoriali primarie). Può anche essere utilizzato, con poche o nessuna modifica, per le cellule in coltura monostrato placcato ampiamente. L&#39;analisi colocalizational è possibile anche in fette di tessuto e di altre tali preparati 11, tuttavia i componenti di trattamento farmacologico e il fissaggio del tessuto / preparazione non sarebbe appropriato. <p class="jove_con...

Recettori, soprattutto G recettori accoppiati alle proteine ​​(GPCR), sono regolarmente vittime della tratta intracellulare, da e verso la superficie cellulare 1. Questi processi complessa orchestrati e strettamente controllate dettano complementi recettori disponibili cellule &#39;e regolano l&#39;attività del recettore temporali, la desensibilizzazione, e risensibilizzazione 2-4. È importante sottolineare che questi processi sono sensibili agli ambienti cellulari tra cui l&#39;attività del recettore indotta da farmaci o di inattività. Cioè, le azioni di ligandi dei recettori possono alterare traffico intracellulare di tali recettori, alterando così la risposta delle cellule. In questo modo, leganti esterni esercitano ancora più effetti sulla funzione delle cellule, anche al di là classiche cascate 5,6 messenger-to-effettori. Esaminando tali cambiamenti nel traffico recettoriale indotta è difficile. Tutte le tecniche disponibili prevedono limitazioni. Saggi di protezione biotina sono stati utilizzati per monitor recettori superficiali popolazioni. Questi recettori sono biotinilati e timecourse di immunoprecipitazione viene eseguita per quantificare la riduzione recettori biotinilati nel tempo. Questa tecnica controlla essenzialmente la progressiva degradazione di una iniziale, etichettati, popolazione di recettori 7, ed è molto utile nella costruzione andamenti temporali di questo processo. Purtroppo, questo test è in grado di monitorare qualsiasi processo diverso degradazione del pool originale di recettori quali internalizzazione, il riciclaggio, o nuovi recettori. Inoltre, l&#39;aggiunta di un anticorpo nell&#39;intervallo 150kDa ad un recettore nell&#39;intervallo 50kDa può alterare il traffico del recettore 8,9, e questa tecnica può essere difficile da usare con recettori basso livello di espressione. Altre procedure utilizzano vari metodi per identificare intracellulari comparti di traffico (ad esempio, endosomi, etc.) e valutare la loro colocalizzazione con i recettori di interesse. Questo include l&#39;use dei sistemi eterologhi esprimono fluorescente proteina-tagged costrutti chimerici dei recettori e marcatori vano (GTPasi esempio, Rab-familiari). Ciò consente potenzialmente l&#39;uso di live-cell imaging, eliminando le questioni relative alla fissazione e permeabilizzazione. Mentre potente, tale strategia soffre delle stesse limitazioni dei sistemi eterologhi in generale: effetti della modifica e del livello di espressione sul traffico di comportamento e di incompatibilità con tipi di cellule più rappresentativi fisiologicamente. Più comunemente, i coloranti vengono usati per etichettare facilmente compartimenti intracellulari (ad esempio, lisosomi, apparentemente) 10. Coloranti, tuttavia, possono mancare di specificità (tutti organuli acidi nel caso dei coloranti per lisosomi) e non valutare il traffico attraverso altri comparti. Tuttavia, queste tecniche consentono un notevole controllo sul sistema e le condizioni sperimentali e possono beneficiare di metodi di analisi colocalization presentati qui di seguito. Il metodo we presente qui raffina il monitoraggio del traffico dei recettori per colocalizzazione. Utilizzando immunocitochimica (ICC) per etichettare marcatori appropriati, è possibile identificare più compartimenti intracellulari distinti. Questo consente anche l&#39;uso di fisiologicamente rilevanti colture cellulari primarie in luogo dei sistemi eterologhi. Questo protocollo ICC prevede che fissa i cellule di interesse prima di etichettatura; questo permette etichettatura a timepoint specifica seguente trattamento farmacologico (s). Questo produce un &#39;istantanea&#39; di associazioni recettore scomparti globali in quel timepoint. Con diversi momenti, una timecourse di cambiamenti di traffico può essere costruito. In breve, le cellule sono trattati con farmaci, etichettati per il recettore e compartimento intracellulare di interesse, confocally ripreso, e le fotomicrografie vengono analizzati per quantificare matematicamente colocalizzazione del recettore e vano 11. Nel nostro uso, abbiamo esaminato la colocalizzazione di un recettore con Rab5, Rab11, e-lisosomiale associata proteine ​​di membrana 1 (LAMP1). Questi marcatori identificano endosomi precoci, endosomi riciclaggio, e lisosomi, rispettivamente. Queste misure colocalizzazione agiscono come proxy per i processi generali della internalizzazione, riciclaggio, e il degrado 12. Come con tutte le tecniche, devono essere considerate alcune limitazioni. A causa della necessità di immagine ogni singolo neurone analizzato, questa tecnica può diventare molto laborioso a seconda del numero di condizioni e timepoints coinvolti. Tutti immunomarcatura deve inoltre vedersela con gli effetti sulla ultrastruttura cellulare, la localizzazione delle proteine, e l&#39;accessibilità epitopo causati dalla fissazione e permeabilizzazione 13. Anche se inizialmente ottimizzato per l&#39;uso con colture primarie di neuroni sensoriali primarie, questo metodo è ampiamente compatibile con altri modelli di coltura monostrato placcato. L&#39;uso di un measur matematicamente quantificatoe di colocalizzazione è, in particolare, molto più metodologicamente rigorosa rispetto alle tecniche precedenti utilizzati per valutare i cambiamenti del traffico dei recettori, che hanno spesso invocato, misure soggettive vaghi come visivamente ispezionati sovrapposizioni multicanale 14. Questa tecnica è particolarmente utile per la sua ampia compatibilità con interventi in vivo (prima generazione coltura primaria), interventi in vitro (durante la crescita coltura), e vari etichettatura obiettivi 15. Come tale, può essere adattata a molte domande di ricerca differenti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7041-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">720084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 circle Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">1254580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua/Poly-Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>00380-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DOR antibody</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS316175</td>
			<td>Used at 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7904</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-853</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-LAMP1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC8098</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drug-induced changes in receptor post-internalization trafficking by colocalizational analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Utilizzando questa tecnica, è possibile quantificare i cambiamenti nel recettore traffico post-internalizzazione seguenti due trattamenti farmacologici cronici / prolungata e acuta. Dopo trattamenti farmacologici, di fissazione, e l&#39;etichettatura, ad alta risoluzione fotomicrografie due canali vengono acquisite di ogni cellula di interesse. Immagini rappresentative possono essere combinati con falsi colori colocalization per generare figure illustrative (Figura 1). Analisi colocalizational successi...

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Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

Traffico Receptor modula la segnalazione e la cellula di risposta ai ligandi ed è, a sua volta, sensibile alle condizioni di cellulari, tra cui la segnalazione ligando-indotta. Qui, descriviamo una tecnica potente e flessibile per la valutazione quantitativa farmaco-indotta traffico recettoriale utilizzando immunomarcatura e analisi colocalizational.

Rilevamento delle modifiche droga indotte recettore post-internalizzazione Tratta di Analisi Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Views.  University of California Irvine.  Traffico Receptor modula la segnalazione e la cellula di risposta ai ligandi ed è, a sua volta, sensibile alle condizioni di cellulari, tra cui la segnalazione ligando-indotta. Qui, descriviamo una tecnica potente e flessibile per la valutazione quantitativa farmaco-indotta traffico recettoriale utilizzando immunomarcatura e analisi colocalizational. 

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Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Ricerca

Biologia

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

Indotta da fattori ambientali modifiche ereditabili nella Lino

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Cambiamenti di equilibrio nella struttura di monitoraggio RNA da &#39;perossidativi&#39; e &#39;ossidativo&#39; Footprinting radicale ossidrile

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

Analisi di SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation E il traffico nelle cellule umane

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

Imaging cellulare dal vivo e analisi 3D del recettore dell&#39;angiotensina di tipo 1a tratta degli transfettati embrionali umane cellule renali Utilizzando Microscopia confocale

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

Rilevamento di Ligand-activated proteina G-recettore accoppiato internalizzazione da microscopia confocale

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

Inseguimento In Vivo dei timociti nell'alloggiamento anteriore dell'occhio di microscopia a scansione Laser in tempo reale

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...