Questo metodo aiuterà i ricercatori a studiare la biologia e la fisiopatologia dei batteri anaerobici che vivono e causano infezioni nel tratto riproduttivo femminile. I precedenti modelli di inoculazione vaginale murina si sono concentrati su batteri cresciuti e recuperati in condizioni aerobiche. Il nostro metodo istruisce sull'inoculazione e il recupero di batteri anaerobici obbligatori, che richiedono strategie aggiuntive per ridurre al minimo l'esposizione all'ossigeno.
A seconda di quanto siano fastidiosi, i nuovi ceppi batterici utilizzati in questo modello possono richiedere modifiche a determinati passaggi. Abbiamo fornito suggerimenti per potenziali modifiche nella tabella uno del manoscritto. Per cominciare, aggiungere 200 microlitri di una coltura batterica di 16 ore a una cuvetta da 1,5 millilitri con 800 microlitri di mezzi freschi in una camera anaerobica.
Quindi ha misurato la densità ottica, o OD, della coltura diluita a 600 nanometri in uno spettrofotometro, usando una cuvetta separata con solo il supporto come bianco. Per ottenere il valore OD effettivo della coltura, moltiplicare la lettura dello spettrofotometro per cinque, quindi determinare il volume di inoculo richiesto per l'esperimento e calcolare il volume della coltura batterica necessaria per ottenere la densità di inoculo richiesta. Quindi, pipettare il volume richiesto di coltura batterica in una provetta di microcentrifuga sterile e centrifugare a 16.000 volte G per uno o tre minuti.
Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet in PBS anaerobico per ottenere il volume richiesto di inoculo calcolato in precedenza. Per determinare il numero di unità che formano colonie batteriche nell'inoculo preparato, utilizzare innanzitutto 10 microlitri della sospensione batterica per effettuare diverse diluizioni seriali in PBS e utilizzare una pipetta multicanale per individuare le diluizioni dell'inoculo su piastre di agar. Allo stesso tempo, preparare i tubi di lavaggio vaginale nella camera anaerobica pipettando 70 microlitri di PBS anaerobico sterile in tubi di microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettati con numeri di topo.
Chiudere ermeticamente i tubi e portarli fuori dalla camera. Per eseguire il lavaggio vaginale, in primo luogo, posizionare un topo sopra una gabbia che può afferrare con le zampe anteriori. Quindi, afferrare delicatamente la parte centrale della coda e sollevarla in modo che i quarti posteriori siano leggermente elevati e l'apertura vaginale sia esposta.
Dopo aver aspirato 50 microlitri di PBS dal tubo di lavaggio etichettato, inserire delicatamente la punta della pipetta da due a tre millimetri nel lume vaginale per lavarla con PBS mediante pipettaggio dentro e fuori tre o quattro volte. Quindi, trasferire nuovamente il materiale di lavaggio nel tubo di lavaggio originale con i restanti 20 microlitri di PBS inutilizzato. Immediatamente dopo questa lavanda vaginale, inoculare ogni topo trasferendo vaginalmente 20 microlitri della sospensione batterica o del controllo del veicolo.
Per gli esperimenti di co-inoculazione con due diversi ceppi batterici, inoculare separatamente con 10 microlitri di ciascuna sospensione batterica, piuttosto che mescolare i ceppi in anticipo. Per evitare che il volume somministrato si accumuli immediatamente nell'introito vaginale, continuare a tenere la parte posteriore del topo per 10-20 secondi. Trasferire il topo inoculato in una nuova gabbia o con compagni di gabbia già inoculati e ripetere la procedura con gli altri topi.
Dopo aver inoculato tutti i topi, ottenere le unità formanti colonie post-inoculo placcando le diluizioni seriali dell'inoculo nella camera anaerobica. Per raccogliere organi di topo, preparare tubi di raccolta di organi da cinque millilitri nella camera anaerobica aggiungendo un millilitro di PBS anaerobico sterile a ciascun tubo per vagine e cervici. Aggiungere 750 millilitri di PBS ai tubi contrassegnati per le corna uterine.
Per raccogliere il lavaggio finale al sacrificio, preparare un altro set di tubi di lavaggio vaginale come dimostrato in precedenza. Inoltre, per il risciacquo e la sterilizzazione degli strumenti di dissezione, preparare un becher da 50 millilitri di acqua deionizzata e un becher da 50 millilitri di etanolo dal 70 al 90%. Immediatamente prima o dopo aver sacrificato i topi, eseguire il lavaggio finale come dimostrato in precedenza.
Dopo il sacrificio, spruzzare l'addome e la schiena di un topo con il 70% di etanolo. Quindi, utilizzare forbici sterilizzate con etanolo e asciugate per aprire la cavità pelvica addominale del topo con tagli verticali. Quindi, utilizzare la pinza per tirare indietro la pelle.
Per esporre il tratto riproduttivo, spingere delicatamente l'intestino fuori dalla cavità corporea sul lato del campo aperto e rimuovere la vescica dal topo per accedere alla parte inferiore del tratto riproduttivo. Successivamente, tagliare il centro dell'osso pubico con le forbici senza tagliare la vagina. Quindi, utilizzare due serie di pinze per afferrare ciascun lato del bacino e tirare il bacino aperto lateralmente per esporre la parte inferiore della vagina sottostante.
Afferrare delicatamente la cervice con una pinza e tirarla verso l'alto per esporre il colon. Successivamente, utilizzare piccole forbici per liberare la vagina dai tessuti connettivi esterni. Rilasciare con attenzione la vagina dal colon senza perforare il tratto intestinale.
Quando la vagina è completamente rilasciata dal colon, usare le forbici per fiancheggiare la vagina all'introito e poi tagliare per rimuoverlo dal corpo del topo. Mantenendo una presa delicata sulla cervice, tirarla verso l'alto per rendere le corna uterine più visibili e tagliare direttamente sotto le ovaie sui lati destro e sinistro per rilasciare le corna uterine. Quindi, rimuovere il tratto riproduttivo dal corpo del topo e metterlo in una capsula di Petri sterile.
Quindi, usando una lama di rasoio, separare le corna uterine, la cervice e la vagina. Posizionare ogni fazzoletto nella rispettiva provetta di raccolta etichettata. Per omogeneizzare gli organi, preparare un omogeneizzatore portatile in un armadio di biosicurezza.
In primo luogo, preparare un set di tre tubi da 50 millilitri con acqua deionizzata, etanolo al 70% e PBS, rispettivamente, per lavare le lame dell'omogeneizzatore dopo aver omogeneizzato ciascun organo. Per pulire l'omogeneizzatore, immergere la lama nel tubo dell'acqua e accendere la macchina a tutta velocità per circa tre secondi. Quindi, agitare la lama su un tovagliolo di carta per rimuovere l'acqua in eccesso.
Risciacquare la lama successivamente in etanolo al 70% e PBS. Dopo il risciacquo iniziale, abbassare la sonda omogeneizzatore sul fondo di un tubo con organi per intrappolare il tessuto sottostante. Quindi, accendere l'omogeneizzatore per macinare il tessuto e spostare delicatamente la sonda su e giù circa cinque volte, tenendola sommersa.
Spegnere e rimuovere l'omogeneizzatore e garantire visivamente la completa interruzione del tessuto. Dopo l'omogeneizzazione, riportare il campione nella camera anaerobica ed eseguire la diluizione seriale per il recupero della CFU. Seguendo questo protocollo, il recupero di batteri vitali e l'enumerazione delle unità formanti colonie dai lavaggi vaginali potrebbero essere eseguiti con successo per i ceppi batterici, Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia e Fusobacterium nucleatum.
Inoltre, il numero di unità formanti colonie di Gardnerella vaginalis ottenute da lavaggi vaginali era correlato con quelle recuperate dagli omogenati del tessuto vaginale. Questo metodo ha anche rivelato che i titoli di Prevotella bivia e i tessuti uterini del topo erano significativamente più alti durante la co-infezione con Gardnerella vaginalis rispetto alla mono-infezione da Prevotella. Inoltre, questo metodo potrebbe essere utilizzato con successo per confrontare la persistenza vaginale di un ceppo mutante di Fusobacterium nucleatum con quella del wild type a 24 e 72 ore dopo l'inoculazione.
Per studiare la risposta immunitaria all'inoculazione batterica vaginale, i test delle citochine possono essere eseguiti sugli omogenati tissutali. In alternativa, i tessuti potrebbero essere salvati per l'esame istologico per valutare i segni di infiammazione.
