Il protocollo qui descritto fornisce agli investigatori un metodo per studiare i neutrofili orali all'interno di un modello animale indotto dalla legatura della malattia parodontale in modo analogo ai partecipanti umani. Il principale vantaggio di questa tecnica è evidenziato dall'aumento del volume di tessuti gengivali infiammati disponibili per l'analisi successiva, che riduce l'uso degli animali. La nostra capacità di recuperare le legature rivestite di biofilm da intorno ai denti consente la simulazione di un trattamento efficace di una malattia parodontale localizzata.
L'uso di questo modello potrebbe essere applicato nello studio degli effetti sistemici della parodontite in un modello animale, a causa dell'aumento delle aree dei tessuti gengivali infiammati. Si consiglia vivamente di familiarizzare con l'uso di strumenti microchirurgici e microscopi a dissezione, nonché di legare i nodi del chirurgo prima di maneggiare soggetti animali vivi. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale per ridurre la lunghezza della curva di apprendimento necessaria per ottenere un posizionamento competente della legatura.
A dimostrare la procedura sarà Jeff Chadwig, uno studente laureato del mio laboratorio. Inizia posizionando il mouse su una piattaforma chirurgica riscaldata. Dopo aver fatto in modo che il mouse sia adeguatamente anestetizzato, stabilizzare la mascella e la mascella in posizione aperta utilizzando elastici.
Puntellare il collo con un rotolo di cotone per mantenere la mascella in posizione orizzontale e coprire il corpo e la coda per mitigare la perdita di calore. Posizionare il microscopio chirurgico all'ingrandimento e all'illuminazione desiderati sulla cavità orale. Utilizzare le forcelle scheggia per installare una sutura di seta intrecciata sterile 50 o più piccola intorno ai molari mascellari M1 e M2 all'interno del solco gengivale.
Posizionare la coda distale della sutura sul lato palatale della dentizione e inserire il segmento prossimale tra il contatto di M2 e M3. Quindi, avvolgerlo intorno alla superficie buccale di M2 e inserirlo tra il contatto di M1 e M2. Assicurarsi che entrambe le estremità della sutura siano tirate saldamente per guidarla verso il solco gengivale. Avvolgere il segmento di sutura prossimale intorno a M1 sotto la sua altezza di contorno e inserirlo tra il contatto di M1 e M2. Tirare saldamente la coda prossimale della sutura per rimuovere tutto il margine di flessibilità. Legare le estremità della sutura con il nodo di un chirurgo e tagliare le code il più in modo possibile.
Posizionare il nodo nell'embrasure gengivale tra M1 e M2 sul lato palatale della dentatura mascellare. È fondamentale che il nodo utilizzato per fissare la legatura sia sicuro e in posizione in cui non irriterà l'animale o interferirà con la masticazione. Dopo l'installazione della legatura, rimuovere il mouse dall'apparato chirurgico e posizionarlo in una gabbia pulita sotto una lampada termica, assicurandosi di monitorarlo fino a completo recupero.
Sterilizzare gli strumenti chirurgici nello sterilizzatore di perline di vetro caldo tra ogni soggetto animale. Ospitare singolarmente ogni topo con l'adeguato arricchimento ambientale e consentire l'accesso ad libitum all'acqua filtrata e al purè di chow standard in un ambiente controllato da temperatura e umidità per sette-11 giorni. Quando è pronto per raccogliere campioni, utilizzare una pipetta per risciacquare la cavità orale con 100 microlitri di PBS sterilizzato di quattro gradi Celsius senza calcio e magnesio per 10 secondi.
Ripetere il risciacquo altre due volte, posizionando ogni risciacquo nella stessa provetta sterile conica da 15 millilitri per ogni animale. Eseguire il contenuto di ogni tubo da 15 millilitri attraverso un filtro a rete di nylon da 40 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri e trasferire il filtrato in una nuova provetta da 15 millilitri. Aggiungere 33,3 microlitri di paraformaldeide al 16% per facilitare la fissazione del campione.
Vortice immediatamente i campioni e incubarli sul ghiaccio per 15 minuti. La paraformaldeide è il reagente più pericoloso utilizzato nel protocollo e deve essere maneggiata con i dispositivi di protezione individuale raccomandati dal produttore. Dopo l'incubazione, riempire il tubo a 15 millilitri con PBS, quindi centrifugarlo a 1000xg e quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Aspirare il supernatante, sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di tampone FACS a quattro gradi Celsius e contare le cellule su un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato. Ripetere la centrifugazione e aspirare il supernatante. Quindi, sospendere di nuovo il pellet di cellule in un volume appropriato di tampone FACS per una concentrazione finale da 500.000 a 1 milione di celle per 50 microlitri di tampone FACS e trasferire le celle nel tubo FACS.
Aggiungere un microlitro di siero di ratto e due microlitri di anticorpi IGG anti-topo a 50 microlitri del campione. Vortice immediatamente il campione e bloccarlo sul ghiaccio per 20 minuti. Quindi, aggiungere gli anticorpi appropriati a ciascun campione.
Vortice e incubare sul ghiaccio per 30 minuti al buio. Dopo l'incubazione, lavare i campioni con un millilitro di tampone FACS, vortice brevemente e centrifugare per cinque minuti a 1000xg e quattro gradi Celsius. Scaricare il supernatante e bloccare delicatamente l'apertura del tubo FACS.
Ripetere il lavaggio due volte, quindi sospendere di nuovo i campioni in 250 microlitri di buffer FACS per la conservazione. Coprire i tubi con pellicola di paraffina, avvolgerli in un foglio di alluminio e conservarli a quattro gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'analisi. La citometria a flusso è stata utilizzata per analizzare i neutrofili recuperati da un risciacquo orale da un topo ingenuo, così come un risciacquo orale e una legatura recuperata da un topo con parodontite indotta dalla legatura.
Per valutare la perdita ossea alveolare, i livelli ossei alveolari sono stati misurati dalla cresta ossea alveolare alla giunzione cementoenamel per topi sani e legati. Quindi, sono state calcolate le differenze di misurazione. Sebbene non venga esaminata qui, la valutazione istopatologica, immunoistochimica e morfometrica del parodonto e dell'osso alveolare può anche essere intrapresa a seconda della domanda di ricerca.
Questo modello è attualmente utilizzato nel mio laboratorio per studiare gli effetti del sistema immunitario innato orale sulla salute e sulle malattie sistemiche.
