Questo protocollo fornisce un nuovo metodo per una vecchia tecnica e fornirà un nuovo approccio per un gran numero di ricercatori scientifici di base. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua natura economica e la sua adattabilità ad essere utilizzata da un pubblico scientifico più ampio. Per preparare una piastra di migrazione, utilizzare un marcatore permanente di colore chiaro per disegnare una linea lungo il centro della parte posteriore di ogni pozzo di una piastra di 48 pozzi e per disegnare tre segni hash per dividere ciascuno bene in tre aree di interesse separate.
Quindi placcare da 1,5 a due volte 10 al quarto fibroblasti cardiaci a passaggio singolo in ogni pozzo e colturare le cellule in condizioni di coltura normali per 24-48 ore fino a raggiungere il 90-95% di confluenza. Quando le cellule sono pronte, rimuovere il supernatante da ogni pozzo e utilizzare una punta sterile della pipetta P200 per fare un graffio di un passaggio lungo le linee disegnate. Risciacquare i pozzi con mezzo siero basso per rimuovere eventuali fibroblasti cardiaci non attaccati e aggiungere 500 microlitri di mezzo siero basso ad ogni pozzo.
Se vengono utilizzati agenti farmacologici, aggiungere gli agenti ai pozzi appropriati. Successivamente, utilizzare un microscopio invertito con un obiettivo 20x per catturare due immagini a zero ore per pozzo utilizzando le marcature per posizionare ogni pozzo per consentire l'imaging della metà superiore della linea graffiata. Quindi spostare la piastra per posizionare la metà inferiore della linea graffiata in vista per raccogliere la seconda immagine e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per 24 ore.
Al termine dell'incubazione, lavare ogni bene con PVS non sterile e aggiungere 500 microlitri di paraformaldeide al 4% ad ogni pozzo in una cappa aspirante. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, lavare ogni bene tre volte in PBS fresco per cinque minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, permeabilizzare le celle con 300 microlitri di soluzione permeabilizzante per pozzo e dondolo delicato per 30 minuti a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, sostituire la soluzione permeabilizzante con una macchia blu brillante 1%Kumasi per un'incubazione di 10 minuti con dondolo delicato a temperatura ambiente. Seguito da tre lavaggi di cinque minuti in PBS con dondolo. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 300 microlitri di PBS a ciascun pozzo e posizionare con cura la piastra nella stessa posizione dell'immagine a zero ore prima di catturare due immagini 24 ore su 24 e come dimostrato.
Alla fine dell'esperimento, apri le immagini e un programma software di analisi delle immagini appropriato e crea un nuovo livello sull'immagine dell'ora zero. Fate doppio clic per modificare il nome del nuovo livello linea di livello e selezionate lo strumento pennello. Modificare la dimensione dei pixel in 10 e il colore in rosso e disegnare due linee separate per delineare il graffio.
Le linee non devono toccare alcuna parte. Aprire l'immagine 24 ore su 24 nel software di imaging e selezionare lo strumento di spostamento. Tenendo premuto il pulsante di controllo, fare clic sia sulle linee che sui livelli di sfondo, fare clic al centro dell'immagine dell'ora zero e trascinare entrambi i livelli al centro dell'immagine di 24 ore.
Nell'immagine 24 ore su 24 fare clic sul livello di sfondo dell'ora zero e modificare l'opacità al 50%Tenendo premuto il pulsante di controllo, fare clic sui livelli di sfondo e linea dell'ora zero e fare clic su Modifica e trasformazione libera per trasformare liberamente i livelli Utilizzando la trasformazione libera, allineare lo sfondo dell'ora zero e le immagini di linea all'immagine di sfondo 24 ore su 24 in modo che le linee di migrazione dell'area siano posizionate correttamente nell'immagine 24 ore su 24. Quando il livello linea è stato sovrapposto correttamente, fare clic con il pulsante destro del mouse per eliminare il livello di sfondo dell'ora zero. Il livello linea rimanente può essere utilizzato per determinare il numero di celle migrate nell'area scratch per 24 ore.
Quindi salva la nuova immagine di migrazione sia come photoshop che come file TIFF o JPEG. Per quantificare il numero di celle di migrazione, aprire l'immagine di migrazione e un programma che accetta file TIFF o JPEG e contare manualmente il numero di celle situate nel mezzo e toccare le due linee rosse per entrambe le immagini per ogni pozzo. Registrare quindi il numero di celle di migrazione per immagine.
Per determinare l'area di migrazione, aprire l'immagine 24 ore su 24 contenente le linee di migrazione nel software di imaging e salvare l'immagine come immagine dell'area di migrazione. Dopo il salvataggio, fate clic sul livello di sfondo e fate clic con il pulsante destro del mouse per eliminare il livello. Usa lo strumento pennello per riempire l'area tra le linee scratch, con lo stesso colore usato per le linee e fare clic su immagine, modalità e scala di grigi per modificare l'immagine in bianco e nero.
Salvare l'immagine e aprire l'immagine dell'area di migrazione e un programma software di analisi delle immagini appropriato. Fare clic su Modifica e invertire. Per determinare l'area della linea di migrazione, fare clic su immagine, regolazione e soglia.
L'area di migrazione nera diventerà rossa e l'area percentuale verrà indicata nella casella di soglia. Registrare quindi l'area percentuale per la riga di migrazione e verificare che questo valore sia associato al numero di celle di migrazione per la stessa immagine. In questa analisi, 46 fibroblasti provenienti da cuori non diabetici e 129 fibroblasti da cuori diabetici migrarono durante il periodo di tempo sperimentale di 24 ore.
La misurazione dell'area di migrazione, come dimostrato, ha rivelato che l'area scratch non diabetica ha costituito il 24,78% dell'area totale misurata, mentre l'area scratch della migrazione diabetica ha costituito il 16,77% dell'area totale misurata. La normalizzazione all'area di migrazione fornisce una valutazione migliore e più rigorosa della migrazione cellulare e nega il potenziale errore umano. Ad esempio, se si confronta solo il numero di fibroblasti migrati, in questa analisi sembrerebbe che il numero di cellule migrate in questo pozzo fosse il doppio di quello delle cellule migrate nel secondo pozzo.
Quando l'area del graffio è stata utilizzata per normalizzare i dati, tuttavia, il rapporto tra i fibroblasti e l'area di migrazione è stato osservato essere quasi lo stesso in entrambi i pozzi. Assicurati di riconquistare l'area di migrazione nell'immagine 24 ore su 24, come acquisito nell'immagine a zero ore. Seguendo questa procedura, l'immunoistochimica può essere condotta per esaminare l'espressione proteica all'interno delle cellule.
Riteniamo che questo nuovo approccio al test sulla migrazione dei gratta e vinci consentirà l'apertura di più vie di ricerca scientifica che in precedenza non erano disponibili.
