Questo protocollo descrive un test colorimetrico ad alto rendimento nelle tre fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi per identificare nuovi farmaci candidati per la malattia di Chagas. Questo può essere usato per identificare i composti tripanocidi in modo facile, veloce e riproducibile. A dimostrare la procedura sarà Romina Manarin, tecnico di laboratorio di coltura cellulare del laboratorio del presepe Pamela.
Inizia coltivando beta galattosidasi che esprime Trypanosoma cruzi epimastigotes in un pallone di coltura tissutale T-25 e incuba a 28 gradi Celsius per farli crescere axenicamente. Utilizzando una camera Neubauer, quantificare la crescita del parassita prima della subculturazione. Per mantenere le colture in una fase di log, sottocoltura ogni 48-72 ore in cinque millilitri di mezzo LIT integrato con 10% FCS e geneticina in solfato ad una concentrazione finale di 200 microgrammi per millilitro.
Quindi chiudere saldamente il cappuccio prima di incubare a 28 gradi Celsius in posizione verticale. Dalla coltura in fase logaritmica, effettuare una sospensione di epimastigote in mezzo LIT integrata con geneticina e solfato alla concentrazione finale di 200.000 cellule per millilitro epimastigote per millilitro. Dopo aver erogato 100 microlitri di sospensione per pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, trucco volume finale di ben 200 microlitri con mezzo.
Fare la sospensione cellulare Vero in DMEM integrata con 2% FCS alla concentrazione finale di 100.000 cellule per millilitro. Semina 100 microlitri della sospensione per pozzetto in una piastra di coltura tissutale da 96 pozzi. Incubare le cellule durante la notte per l'aderenza e il giorno successivo, osservare le cellule al microscopio.
Il giorno successivo, risciacquare il monostrato cellulare Vero tre volte con 100 microlitri di PBS sterile. Aggiungere tripomastitigoti metaciclici ottenuti in precedenza. Aggiungere una molteplicità di infezione o MOI di 10-1 su 100 microlitri di DMEM integrati con il 2% di FCS per pozzetto e incubare per sei ore come dimostrato in precedenza.
Alla fine dell'incubazione, lavare la piastra due volte con PBS e aggiungere 100 microlitri di DMEM senza rosso fenolo integrato con il 2% di FCS. Dopo aver fatto la sospensione delle cellule Vero in DMEM aggiungere la concentrazione finale di 1 milione di cellule per millilitro. Semina 800.000 cellule in cinque millilitri del mezzo in palloni T-25 e incuba durante la notte per l'aderenza cellulare.
Una volta che il pallone è stato risciacquato con PBS, aggiungere tripomastiti, aggiungere un MOI di 10-1 in cinque millilitri di DMEM integrato con 2% FCS e incubare durante la notte come dimostrato in precedenza. Alla fine dell'incubazione, lavare il pallone due volte con PBS. Aggiungere cinque millilitri di DMEM fresco integrato con 2% FCS e incubare per quattro giorni.
Al termine dell'incubazione, dopo aver osservato la presenza del surnatante per i tripomastigoti al microscopio ottico. Quantificare i tripomastimiti utilizzando una camera neubauer. Raccogliere il surnatante in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 7.000 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi scartare il surnatante e risospese il pellet in DMEM senza rosso fenolo integrato con 2% FCS per ottenere una concentrazione di 1 milione di tripomastiti per millilitro. Semina 100 microlitri della sospensione di tripomastigote per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Aggiungere la soluzione di benznidazolo agli epimastigoti, alle cellule Vero con amastigoti o ai tripomastigoti come descritto nel manoscritto del testo.
Quindi incubare gli epimastigoti, impostare 28 gradi Celsius per 72 ore e i tripomastigoti o cellule Vero infette con amastigoti per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per il test coloremetrico, impostare i pozzetti vuoti aggiungendo 100 microlitri di PBS o mezzo corrispondente. Quindi, aggiungere 40 microlitri di soluzione di substrato CPRG e 10 microlitri della soluzione detergente a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale di 200 micromolari CPRG e 0,1% detergente in un volume finale di 250 microlitri in ciascun pozzetto.
Dopo l'incubazione, a 37 gradi Celsius per due ore, misurare l'assorbanza a 595 nanometri utilizzando uno spettrofotometro a micropiastre. Nel software, creare un nuovo protocollo selezionando l'assorbanza come metodo di rilevamento e il punto finale come tipo di lettura, quindi fare clic su OK. Quindi, aggiungi un passaggio di lettura.
Digitate la lunghezza d'onda selezionata e fate clic su OK. Nella sezione layout della piastra contrassegnare i pozzetti da leggere, fare clic su OK e fare clic su leggi lastra, attendere che i valori vengano visualizzati sullo schermo ed esportarli in un foglio di calcolo per analizzare i risultati e calcolare i valori di assorbanza utilizzando la sottrazione come descritto nel manoscritto. Nel software di analisi statistica, tracciare la concentrazione di BZN rispetto all'assorbanza a 595 nanometri nella tabella XY.
Trasformare le concentrazioni di BZN in valori logaritmici facendo clic su Analizza, selezionando l'opzione di trasformazione e facendo clic su OK. Per ottenere i valori IC50, fare clic su Analizza e dall'elenco analisi XY selezionare adattamento curva di regressione non lineare, quindi fare clic su OK. Quindi, vai alla finestra dei parametri, nella scheda del modello, vai al gruppo di inibizione della risposta alla dose delle equazioni incorporate, seleziona l'inibitore del registro rispetto alla pendenza della variabile di risposta per i parametri poiché il metodo di risposta alla dose lascia tutte le altre schede ai valori predefiniti e quindi fai clic su OK.
Fai clic sulla sezione dei risultati per trovare il valore IC50, la SD e la bontà della vestibilità. Fare clic sulla sezione del grafico per trovare il grafico XY della concentrazione logaritmica del farmaco rispetto ai valori di assorbanza e assicurarsi che anche l'adattamento della curva sia rappresentato graficamente in un colore diverso. Nel presente studio, il valore IC50 ottenuto per gli epimastigoti era di circa 20 micromolari, simile agli studi precedenti.
Inoltre, i risultati hanno indicato l'attività della beta galattosidasi di liner degli epimastigoti nel tempo. È molto importante eseguire almeno repliche di ogni condizione testata e ridurre al minimo gli errori nella gestione del volume.
