This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).

1. Preparazione dell&#39;apparecchiatura <ol><li> Ottenere un barattolo chemostat (150-250 ml) o una beuta (250 ml) contenente una luce di ingresso ed una luce di uscita. Collegare le porte con tubo in silicone che consente portate di 10-100 ml / h. Facoltativamente, utilizzare una presa d&#39;aria, una porta di uscita dell&#39;aria, e le porte di ingresso e uscita a temperatura controllata. </li><li> Ottenere un dispositivo adatto per il barattolo chemostat che prevede l&#39;agitazione e la temperatura di controllo (o utilizzare un incubatore agitazione rotante). </li><li> Ottenere due pompe peristaltiche per erogare mezzo fresco e raccogliere la cultura. </li><li> Ottenere un vaso serbatoio (10-20 L) contenente una porta di uscita media e una porta di ingresso dell&#39;aria. </li><li> Ottenere tubo in silicone adatto per il tasso di diluizione (ad esempio, ID 0,8 mm campo di portata 0,06-36 ml / min; L / S 13 tubi). </li></ol> 2. Preparazione medio e sterilizzazione <ol><li> Media iniziale <ol><li> Sciogliere 0,3 g di glucosio, 0,08 g NH 4Cl, 0,05 g di NaCl, 0,75 g di Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, e 0,3 g KH 2 PO 4 in 90 ml di acqua distillata (DW) in un vaso chemostato. </li><li> Sigillare il vaso chemostat insieme con il tubo con fascette. Non sigillare la presa d&#39;aria. </li><li> Sterilizzare il vaso chemostat in autoclave a 121 ° C per 15 min. Dopo la sterilizzazione, conservare il barattolo chemostat a temperatura ambiente. </li><li> Sciogliere 0,02 g MgSO 4 · 7H 2 O, 0,01 g CaCl 2, e 0,1 mg di tiamina in 10 ml DW (soluzione A). </li><li> soluzione Filter A utilizzando una siringa e un filtro a siringa pre-sterilizzato (un filtro da 0,45 micron pori). </li><li> Aggiungere la soluzione A filtra al barattolo chemostat. </li></ol></li><li> Lo stress medio <ol><li> Sciogliere 30 g di glucosio, 8 g di NH 4 Cl, 5 g di NaCl, 75 g di Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 30 g KH 2 PO 4, e 300 g di disodio succinato esaidrato (Na 2 · succinato · 6H &lt;sub&gt; 2 O; il fattore di stress utilizzato in questo esperimento) in 9,9 L DW in un barattolo serbatoio. </li><li> Sigillare il vaso serbatoio con il tubo con fascette. Non sigillare la presa d&#39;aria. </li><li> Sterilizzare il vaso serbatoio in autoclave a 121 ° C per 15 min. Dopo la sterilizzazione, conservare il vaso a temperatura ambiente. </li><li> Sciogliere 2 g MgSO 4 · 7H 2 O, 1 g CaCl 2, e 10 mg di tiamina in 100 ml DW (soluzione A). </li><li> Filtro soluzione A con una siringa e un filtro a siringa pre-sterilizzato (un filtro da 0,45 micron pori). </li><li> Aggiungere la soluzione A filtra al barattolo serbatoio. </li><li> Asetticamente collegare il tubo di silicone sterilizzato al barattolo serbatoio e collegare le pompe peristaltiche. </li></ol></li><li> -Stress elevato Media <ol><li> Preparare il mezzo come nella sezione 2.2, ma con una maggiore concentrazione di stress (cioè, 3-5 g / L elevato nell&#39;adattamento succinato). Nota: Questo protocollo è per l&#39;adattamento ad una sollecitazione thin possono essere consegnati attraverso il mezzo. Nel caso di stress fisici quali temperatura, agitazione, o l&#39;illuminazione, la coltivazione dovrebbe essere progettato di conseguenza. </li></ol></li></ol> 3. La coltivazione iniziale <ol><li> Inoculare una singola colonia di wild-tipo E. coli in una provetta da 15 ml contenente 4 ml di terreno iniziale. </li><li> Incubare la provetta in un incubatore agitazione per 12 ore a 37 ° C e 220 rpm. </li><li> Trasferire asetticamente 1 ml di precoltura al barattolo chemostat. </li><li> Incubare il vaso chemostat, prevedendo aerazione (aria 50 ml / min) e l&#39;agitazione (200 rpm), a 37 ° C per 6 ore. </li></ol> 4. Lo stress Adattamento <ol><li> Asetticamente collegare l&#39;estremità del tubo in silicone dalle pompe al vaso chemostat. </li><li> Avviare la pompa di scarico (10 ml / h o superiore) e raccogliere la cultura. Nota: La coltura deve essere in fase esponenziale, tipicamente 4-8 ore dopo la coltivazione iniziale. </li><li> Check la densità ottica (600 nm) della cultura dal tubo di uscita. </li><li> Avviare la pompa di aspirazione (10 ml / h, corrispondente ad un tasso di diluizione 0,1 hr -1). </li><li> Controllare la densità ottica della coltura a 600 nm dalla presa tubo ogni 24 ore. </li><li> Azionare il chemostat per 96 ore (fatturato 9,6 volte) o più. Se la densità ottica è stabile, scambiare il serbatoio contenente il mezzo high-stress. Se la densità ottica è inferiore a 0.2, fermare la pompa di aspirazione alimentazione per 6 ore. Riavviare la pompa di aspirazione e verificare che la densità ottica è di 0,2. </li><li> Gradualmente aumentare la concentrazione del fattore stressante cambiando ad un serbatoio contenente una concentrazione di stress elevato. </li><li> Prelevare campioni della cultura adattato ogni volta che raggiunge un traguardo (ad esempio, un ceppo atto a 100 g / L di stress succinato), e memorizzare per ulteriori analisi genomica. </li><li> Per la conservazione del campione, mescolare il campione di coltura (0,5 ml) con un sterilizzato 80% glicerolo solution (0,5 ml) e conservarlo a -80 ° C. Nota: Se il microrganismo acquisisce la capacità di degradare il fattore di stress durante la procedura ALE, la concentrazione di stress nella giara di fermentazione non è la stessa di quella nel serbatoio fresco. </li></ol> 5. Single-colonia isolamento del ceppo stress-adattato <ol><li> Preparare medio piastra di agar (1,6% agar) contenente lo stesso stress e alla stessa concentrazione del mezzo. </li><li> Piatto cultura uscita (0,1 ml) dalla chemostat, e incubare a 37 ° C per 16 ore. </li><li> Raccogliere singole colonie dalla piastra con uno stuzzicadenti sterile e inoculare in provette da 15 ml contenenti la stessa stress e alla stessa concentrazione media come nella chemostato e incubare per 6 ore. </li><li> Trasferire 1 ml di brodo di coltura in un pallone da 250 ml Erlenmeyer contenente 50 ml di terreno. Harvest 0,5 ml di brodo di coltura ogni 1 ora, e misurare la densità ottica a 600 nm. Confrontare il tasso di crescita del strai adattaton a quella del ceppo selvatico dato il fattore di stress. </li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

I microrganismi sono in grado di adattarsi a quasi tutti gli ambienti a causa del loro rapido tasso di crescita e la diversità genetica. Adaptive evoluzione di laboratorio permette di evolvere microrganismi in condizioni progettati, che fornisce un modo di selezionare gli organismi individuali harboring mutazioni spontanee che sono favorevoli nelle condizioni date. La tecnica chemostat è più robusto per realizzare evoluzione artificialmente guidato di tecniche di trasferimento per i seguenti motivi: (a) un ambiente stabile - perché tecniche di trasferimento sono basati su colture in lotti sia sul solido o in mezzo liquido, l&#39;ambiente delle cellule varia durante lotto cultura, mentre lo stress ambientale del chemostat è costante; (B) una popolazione più ampia e una selezione continua - la più grande popolazione del chemostat fornisce più la diversità genetica rispetto alla più piccola popolazione di tecniche di trasferimento. selezione continua della chtecnica emostat è un modo più veloce per raggiungere l&#39;evoluzione di selezione intermittente di tecniche di trasferimento. E &#39;fondamentale che la cultura chemostat non essere contaminato da altri microrganismi durante la procedura di ALE e condizioni asettiche sono tenuti in tutta la cultura chemostat. La procedura ALE può essere modificato da modifiche a fattori di stress, come lo stress ossidativo, stress osmotico, e lo stress prodotto tossico. Ci sono alcune limitazioni tecniche a ALE di cultura chemostat. L&#39;evoluzione avviene per caso; Pertanto, diversi ricercatori possono non essere in grado di ottenere lo stesso risultato evolutivo, anche se le conseguenze delle mutazioni potrebbero essere collegati. Un&#39;altra limitazione è il wash-out della cultura chemostat quando la concentrazione di stress è aumentata troppo velocemente. Se la biomassa viene diminuito per una certa quantità (cioè, OD = 0.2 in questa procedura) dopo la concentrazione di stress è aumentata, la somministrazione del fattore di stress deve essere arrestato per almeno alcune generazioni adare il tempo di adattarsi ceppo. I recenti sviluppi nella tecnologia di sequenziamento del genoma hanno aiutato la comprensione delle mutazioni che si sviluppano in risposta a determinate condizioni di stress. Ad esempio, una mutazione del DNA altera un particolare effetto sistemico che è vantaggioso per l&#39;ambiente data (cioè tolleranza uno stress tossico). Così, ALE può essere utilizzato per studiare la funzione del gene o regolazione di rete, o come materia prima per &#39;evoluzione accelerata&#39;. studi ALE sono utili anche nel simulare lo sviluppo di batteri resistenti agli antibiotici, indicando i meccanismi con cui si presentano pericolose farmaco-resistenti ceppi batterici. Come la traiettoria di evoluzione è inciso sul genoma, scoprendo le alterazioni genetiche che portano a fenotipi desiderati (come ad esempio la tolleranza allo stress) è l&#39;ostacolo successivo ceppi volta evoluti si ottengono 8. Tra le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione attualmente disponibili, la piattaforma Illumina e Ion Torrentforme sono adatti per il rilevamento di sostituzioni nucleotidiche o piccoli indels che si verificano nei ceppi evoluti, ed entrambi sono accessibili. Poiché rilevamento variante solito comporta mappatura breve lettura delle sequenze di riferimento, la disponibilità della sequenza del genoma del ceppo ancestrale è cruciale. Anche se la sequenza del genoma del ceppo fondatore è disponibile da database pubblici, è spesso desiderabile sequenziare simultaneamente con l&#39;evoluta uno, perché ci potrebbero essere delle differenze aggiuntive nel ceppo reale di partenza. I protocolli per l&#39;identificazione di mutazione sono facilmente reperibili tramite il web o una ricerca bibliografica 9,10. Ad esempio, BRESEQ è una pipeline appositamente progettato per l&#39;analisi genomica di microbi in laboratorio si è evoluta con la prossima generazione di dati di sequenziamento 11. Il confronto dei ceppi evoluti in determinati traguardi (per esempio, in questi dati rappresentativi, wild-type, DST50, DST100, e DST160) in grado di fornire la sequenza del ceppo evolutos e dare comprensione delle conseguenze di un dato fattore di stress. Pertanto, la conoscenza e le applicazioni di esperimenti ALE, insieme con la biologia del sistema e l&#39;individuazione delle variabili di perturbazione sistemici, sono attesi nel prossimo futuro.

I microrganismi possono sopravvivere e di adattarsi ad ambienti diversi. Sotto stress grave, l&#39;adattamento può avvenire attraverso l&#39;acquisizione di fenotipi benefici da mutazioni genomiche casuali e la successiva selezione positiva 1-3. Pertanto, le cellule microbiche in grado di adattarsi cambiando metabolica o reti di regolazione per una crescita ottimale, che viene definito &quot;l&#39;evoluzione adattativa&quot;. Recenti importanti tendenze microbici, come focolai di superbatteri e la comparsa di ceppi microbici resistenti, sono strettamente correlate a adattivo evoluzione in condizioni di stress. In condizioni di laboratorio definite, siamo in grado di studiare i meccanismi di evoluzione molecolare e anche controllare la direzione di evoluzione microbica per varie applicazioni. Diversamente organismi multicellulari, organismi unicellulari sono adatti all&#39;evoluzione laboratorio adattativa (ALE) per i seguenti motivi: si rigenerano rapidamente, mantengono grandi popolazioni, ed è facile per creare e mantenere homambienti ogeneous. In combinazione con i recenti progressi nelle tecniche di sequenziamento del DNA e le tecnologie high-throughput, ALE permette l&#39;osservazione diretta dei cambiamenti genomiche che portano a modifiche normative sistemici. dinamiche mutazionale e una diversità della popolazione sono anche osservabili. Strategie di ingegneria genetica può essere determinata dall&#39;analisi di ceppi ALE 4,5. Cultura chemostat è un metodo utilizzato per ottenere cellule allo stato stazionario e aumentare la produttività nei processi di fermentazione 6. terreno fresco viene aggiunto e brodo di coltura è raccolta durante il processo (quest&#39;ultimo include medio e biomasse). Cultura chemostat A lungo termine, però, cambia la produttività dello stato stazionario della cultura e provoca l&#39;accumulo di mutazioni spontanee e selezione durante la coltura (Figura 1a). Sotto varie pressioni selettive (fattori di stress), l&#39;accumulo di mutazioni è migliorata. Un graduale aumento dello stress in un lungo periodo<html> chemostat prevede una selezione continua di mutazioni che funzionano contro i fattori di stress indicati, quali temperatura, pH, pressione osmotica, nutrienti fame, ossidazione, prodotti tossici, ecc transfer Colony da un supporto solido e trasferimento seriale da un mezzo liquido (ripetuto cultura batch) permettono anche ai ricercatori di ottenere microrganismi evoluti (Figura 1B e 1C). Anche se la cultura chemostat richiede metodi complicati, la piscina della diversità (numero di repliche e dimensione della popolazione) è superiore a quello ottenuto con il trasferimento della colonia e le tecniche di trasferimento seriale. L&#39;esposizione di stress stabile alle singole celle e diminuito variazione di stato cellulare durante la coltura chemostat (stato stazionario) sono altri benefici di ALE rispetto alle tecniche di coltura a base di batch. ALE indotta da stress di Escherichia coli sottoposti a condizioni succinato alto è introdotto in questo articolo. iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Metodi di evoluzione adattativa di laboratorio (A) chemostat;. (B) trasferimento seriale; (C) trasferimento colonia. Le figure principali illustrare il concetto di metodi per ALE, e le figure in basso mostrano il numero di cellule che sono cresciuti durante ALE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Mini-chemostat fermentor</td><td>Biotron Inc.</td><td>-</td><td>manufactured by special order</td></tr><tr><td>silicon tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 13</td><td>tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.</td></tr><tr><td>reservoir jar</td><td>Bellco</td><td>Media storage bottle</td><td>20 L</td></tr><tr><td>chemicals</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>-</td><td>reagent grade</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>ACS reagent</td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>for molecular biology, suitable for cell culture, &amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>ACS reagent, &amp;ge;99%</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4272</td><td>98.5-101%</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td>ACS reagent, &amp;ge;99%</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>ACS reagent, &amp;ge;98%</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td>ACS reagent, &amp;ge;96%</td></tr><tr><td>thiamine&amp;middot;HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td>reagent grade, &amp;ge;99%</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;succinate&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>ReagentPlus, &amp;ge;99%</td></tr></tbody></table>

procedure for adaptive laboratory evolution of microorganisms using a chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Per l&#39;alta-succinato adattamento stress, la wild-type E. coli W3110 ceppo è stato coltivato in un chemostato a D = 0,1 hr -1 per 270 giorni (figura 2). <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> Figura 2: High-succinato sforzo di adattamento di E. coli W3110 con la cultura chemostat. frecce sottili indicano l&#39;ora in cui è stata aumentata la concentrazione di stress, e le frecce in grassetto indicano gli orari in cui sono stati conservati culture. I numeri con frecce indicano le concentrazioni del fattore di stress, sodio succinato esaidrato. La variazione della biomassa durante ALE e le concentrazioni di stress sono rappresentati. Il dato è stato modificato da J. BioSci. Bioeng 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Una concentrazione di stress iniziale di 30 g / L (disodio succinato esaidrato) è stata gradualmente aumentata quando la cultura chemostat uno stato di regime, fino alla concentrazione di stress era di 160 g / L. Il E. adattato coli ceppo DST160 (tolleranti a 160 g / L di stress disodico succinato) è stato acquisito dopo 270 giorni. Il ceppo DST160 esposto crescita disinibita sotto stress alta succinato (160 g / l di stress), mentre il ceppo progenitore (W3110) ha mostrato quasi nessuna crescita (figura 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig3.jpg" /> Figura 3: curve di crescita del wild-type (W3110, cerchio bianco) e adattato ceppo (DST160, cerchio nero) in condizioni di stress alta succinato La figura mostra che il ceppo adattato cresciuto senza indugio, sotto alta succinato condizioni di stress, mentre allo stato selvatico. tipo non ha fatto. L&#39;errorebarre indicano la deviazione standard di tre esperimenti indipendenti. Il dato è stato modificato da J. BioSci. Bioeng 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Procedura per l'evoluzione adattiva dei microrganismi in laboratorio utilizzando un chemostato | Genetica | Video

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Qui, vi presentiamo un protocollo per ottenere adattativa evoluzione laboratorio di microrganismi in condizioni che utilizzano la cultura chemostat. Inoltre, l&#39;analisi genomica del ceppo evoluto è discusso.

Procedura per l&#39;Adaptive Laboratorio evoluzione dei microrganismi Utilizzando un chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

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Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring fitness phenotypes and improving our understanding of how genotypes are shaped by selection. Extensive recent efforts to develop and apply niche continuous culture devices have revealed the benefits of conducting new forms of cell culture control. This includes defining custom selection pressures and increasing throughput for studies ranging from long-term experimental evolution to genome-wide library selections and synthetic gene circuit characterization. The eVOLVER platform was recently developed to meet this growing demand: a continuous culture platform with a high degree of scalability, flexibility, and automation. eVOLVER provides a single standardizing platform that can be (re)-configured and scaled with minimal effort to perform many different types of high-throughput or multi-dimensional growth selection experiments. Here, a protocol is presented to provide users of the eVOLVER framework a description for configuring the system to conduct a custom, large-scale continuous growth experiment. Specifically, the protocol guides users on how to program the system to multiplex two selection pressures &#8212; temperature and osmolarity &#8212; across many eVOLVER vials in order to quantify fitness landscapes of Saccharomyces cerevisiae mutants at fine resolution. We show how the device can be configured both programmatically, through its open-source web-based software, and physically, by arranging fluidic and hardware layouts. The process of physically setting up the device, programming the culture routine, monitoring and interacting with the experiment in real-time over the internet, sampling vials for subsequent offline analysis, and post experiment data analysis are detailed. This should serve as a starting point for researchers across diverse disciplines to apply eVOLVER in the design of their own complex and high-throughput cell growth experiments to study and manipulate biological systems.

The eVOLVER framework enables high-throughput continuous microbial culture with high resolution and dynamic control over experimental parameters. This protocol demonstrates how to apply the system to conduct a complex fitness experiment, guiding users on programming automated control over many individual cultures, measuring, collecting, and interacting with experimental data in real-time.

Progettare esperimenti di crescita cellulare automatizzati, ad alta produttività e continui utilizzando eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli

The Long-Term Evolution Experiment (LTEE) has followed twelve populations of Escherichia coli as they have adapted to a simple laboratory environment for more than 35 years and 77,000 bacterial generations. The setup and procedures used in the LTEE epitomize reliable and reproducible methods for studying microbial evolution. In this protocol, we first describe how the LTEE populations are transferred to fresh medium and cultured each day. Then, we describe how the LTEE populations are regularly checked for possible signs of contamination and archived to provide a permanent frozen "fossil record" for later study. Multiple safeguards included in these procedures are designed to prevent contamination, detect various problems when they occur, and recover from disruptions without appreciably setting back the progress of the experiment. One way that the overall tempo and character of evolutionary changes are monitored in the LTEE is by measuring the competitive fitness of populations and strains from the experiment. We describe how co-culture competition assays are conducted and provide both a spreadsheet and an R package (fitnessR) for calculating relative fitness from the results. Over the course of the LTEE, the behaviors of some populations have changed in interesting ways, and new technologies like whole-genome sequencing have provided additional avenues for investigating how the populations have evolved. We end by discussing how the original LTEE procedures have been updated to accommodate or take advantage of these changes. This protocol will be useful for researchers who use the LTEE as a model system for studying connections between evolution and genetics, molecular biology, systems biology, and ecology. More broadly, the LTEE provides a tried-and-true template for those who are beginning their own evolution experiments with new microbes, environments, and questions.

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli

This protocol describes how to maintain the Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) by performing its daily transfers and periodic freeze-downs and how to conduct competition assays to measure fitness improvements in evolved bacteria. These procedures can serve as a template for researchers starting their own microbial evolution experiments.

Trasferimenti giornalieri, archiviazione delle popolazioni e misurazione dell'idoneità nell'esperimento di evoluzione a lungo termine con Escherichia coli

The Long-Term Evolution Experiment (LTEE) has followed twelve populations of Escherichia coli as they have adapted to a simple laboratory environment for ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the microscale&#8213;to create micro-environments for microbial chemotaxis experiments. To create chemical pulses, we developed a system to introduce amino acid sources near-instantaneously by photolysis of caged amino acids within a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chamber containing a bacterial suspension. We applied this method to the chemotactic bacterium, Vibrio ordalii, which can actively climb these dynamic chemical gradients while being tracked by video microscopy. Amino acids, rendered biologically inert (&#39;caged&#39;) by chemical modification with a photoremovable protecting group, are uniformly present in the suspension but not available for consumption until their sudden release, which occurs at user-defined points in time and space by means of a near-UV-A focused LED beam. The number of molecules released in the pulse can be determined by a calibration relationship between exposure time and uncaging fraction, where the absorption spectrum after photolysis is characterized by using UV-Vis spectroscopy. A nanoporous polycarbonate (PCTE) membrane can be integrated into the microfluidic device to allow the continuous removal by flow of the uncaged compounds and the spent media. A strong, irreversible bond between the PCTE membrane and the PDMS microfluidic structure is achieved by coating the membrane with a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) followed by plasma activation of the surfaces to be bonded. A computer-controlled system can generate user-defined sequences of pulses at different locations and with different intensities, so as to create resource landscapes with prescribed spatial and temporal variability. In each chemical landscape, the dynamics of bacterial movement at the individual scale and their accumulation at the population level can be obtained, thereby allowing the quantification of chemotactic performance and its effects on bacterial aggregations in ecologically relevant environments.

A protocol for the generation of dynamic chemical landscapes by photolysis within microfluidic and millifluidic setups is presented. This methodology is suitable to study diverse biological processes, including the motile behavior, nutrient uptake, or adaptation to chemicals of microorganisms, both at the single cell and population level.

Generazione di paesaggi chimici dinamici e controllati per studiare il comportamento microbico

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Bioingegneria

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and reagents. Moreover, microplate-based high-throughput cultivation methods developed in recent years have poor microbial growth status and experiment parallelization because of their low dissolved oxygen, poor mixture, and severe evaporation and thermal effect. Due to many advantages of micro-droplets, such as small volume, high throughput, and strong controllability, the droplet-based microfluidic technology can overcome these problems, which has been used in many kinds of research of high-throughput microbial cultivation, screening, and evolution. However, most prior studies remain&#160;at the stage of laboratory construction and application. Some key issues, such as high operational requirements, high construction difficulty, and lack of automated integration technology, restrict the wide application of droplet microfluidic technology in microbial research. Here, an automated Microbial Microdroplet Culture system (MMC) was successfully developed based on droplet microfluidic technology, achieving the integration of functions such as inoculation, cultivation, online monitoring, sub-cultivation, sorting, and sampling required by the process of microbial droplet cultivation. In this protocol, wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 and a methanol-essential E. coli strain (MeSV2.2) were taken as examples to introduce how to use the MMC to conduct automated and relatively high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution in detail. This method is easy to operate, consumes less labor and reagents, and has high experimental throughput and good data parallelity, which has great advantages compared with conventional cultivation methods. It provides a low-cost, operation-friendly, and result-reliable experimental platform for scientific researchers to conduct related microbial research.

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

This protocol describes how to use the Microbial Microdroplet Culture system (MMC) to conduct automated microbial cultivation and adaptive evolution. MMC can cultivate and sub-cultivate microorganisms automatically and continuously and monitor online their growth with relatively high throughput and good parallelization, reducing labor and reagent consumption.

Coltivazione microbica automatizzata ed evoluzione adattiva utilizzando il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

L&#39;uso di chemostati in Biologia microbica Sistemi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Biologia

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

Progettazione e utilizzo di matrici chemostato multiplexing

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo di evoluzione sperimentale per l'adattamento termofilo utilizzando termomiscelatori a basso costo

Adaptation at the Extremes of Life: Experimental Evolution with the Extremophile Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures is a key requirement, not only for understanding fundamental evolutionary processes but also for developing S. acidocaldarius as a chassis for bioengineering. One major obstacle to conducting experimental evolution with thermophiles is the expense of equipment maintenance and energy usage of traditional incubators for high-temperature growth. To address this challenge, a comprehensive experimental protocol for conducting experimental evolution in S. acidocaldarius is presented, utilizing low-cost and energy-efficient bench-top thermomixers. The protocol involves a batch culture technique with relatively small volumes (1.5 mL), enabling tracking of adaptation in multiple independent lineages. This method is easily scalable through the use of additional thermomixers. Such an approach increases the accessibility of S. acidocaldarius as a model system by reducing both initial investment and ongoing costs associated with experimental investigations. Moreover, the technique is transferable to other microbial systems for exploring adaptation to diverse environmental conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Comprendere l'adattamento dei microbi utilizzando tecniche innovative per esplorare l'evoluzione termofila

Here, we present an experimental evolution protocol for adaptation in thermophiles utilizing low-cost, energy-efficient bench-top thermomixers as incubators. The technique is demonstrated through the characterization of temperature adaptation in Sulfolobus acidocaldarius, an archaeon with an optimal growth temperature of 75 &#176;C.

Adattamento agli estremi della vita: evoluzione sperimentale con l'estremofilo Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures ...

Procedura per l'Adaptive Laboratorio evoluzione dei microrganismi Utilizzando un chemostat

Riepilogo

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Progettazione e l'uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci