Ringraziamo Dick Foley e Leigh Kimball per il loro ruolo chiave nella ripresa e produzione video.

1. Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) isolamento <ol><li> Ottenere un campione di sangue - sangue deve essere raccolti in siringhe o provette di sangue e anti-coagulato con eparina (1:50 ratio) per prevenire la coagulazione. Aspettatevi una resa di circa 1 × 10 6 PBMC per ml di sangue - circa il 40% dei quali sarà CD4 positivi (CD4 +) le cellule T. </li><li> Aliquota del sangue in 50 mL coniche, 25 ml per provetta. Se il sangue si è separata, mescolare delicatamente prima aliquoting per distribuire il plasma </li><li> Aggiungi PBS, portando il volume totale di 40 ml e alla base attraverso l&#39;elaborazione di 11 ml di Ficoll, inserendo nel tubo di sangue, e con attenzione rimuovere il Aid pipetta dalla pipetta. Il Ficoll lentamente scarico nella parte inferiore del tubo. Una volta che il livello ha pareggiato, rimuovere lentamente la pipetta dal tubo di sangue e scartare. </li><li> Cap tube di sangue e spostare i contenitori in Aerosolve. Chiudere saldamente i contenitori e centrifugare a 900 × g per 20 minuti - senza freno. E &#39;fondamentale che nessun freno alla fine di questo giro, come la forza frenante sarà disturbare lo strato di cellule. </li><li> Dopo lo spin, il PBMC dovrebbero formare uno strato bianco distinta tra il plasma gialla (sopra) e Ficoll trasparente (sotto). Delicatamente sfiorano bianco sporco strato di cellule del sangue con una pipetta di trasferimento e trasferimento a nuovo tubo. Alcuni plasma e Ficoll può essere redatto con l&#39;PBMC, ma evitare di elaborare una qualsiasi dello strato di globuli rossi. Tipicamente due tubi di sangue possono essere combinati in un unico tubo di cellule in questa fase per aumentare la dimensione delle pastiglie. </li><li> Aggiungi PBS, portando il volume totale di 50 ml e centrifugare a 500 × g per 15 minuti - freno a basso contenuto di contenitori aerosolve. </li><li> Aspirare il liquido con una pipetta Pasteur, facendo attenzione a non disturbare il pellet </li><li> Trattare con tampone emolitica con l&#39;aggiunta di 5-6 ml per ogni provetta e mescolare delicatamente per eliminare grumi. Incubare per non più di 5 minuti. </li><li> Aggiungi PBS, portando il volume totale di 50 ml e centrifugare a 230 × g per 10 minuti - freni. Contenitori Aerosolve non sono più necessarie per questi giri più lento. </li><li> Lavare due volte: Aspirare il liquido con una pipetta Pasteur, riempire tubo con PBS e centrifugare a 230 × g per 10 minuti. </li><li> Prima della fase di lavaggio finale, rimuovere una aliquota di cellule risospese, diluire con trypan blu, e contare con un emocitometro. Questo conteggio delle cellule detterà i volumi di reagente utilizzato nella fase di separazione delle cellule T. </li></ol> 2. * Delle cellule CD4 + T separazione <ol><li> Aspirare il liquido e aggiungere tampone di corsa per portare il volume totale fino a 40 uL per 10 milioni di cellule. Di solito questo richiede 30 uL di tampone più il volume residuo di pellet. </li><li> Trasferire questo volume ad un tubo da 15 ml. </li><li> Aggiungi cocktail di anticorpi dal kit isolamento CD4 - 10 uL per 10 milioni di cellule, tubo tappo, e il luogo in ghiaccio per 10 minuti </li><li> Rimuovere la provetta dal ghiaccio, rimuovere il tappo, e aggiungere 30 uL di funzionamento del buffer per 10 milioni di cellule </li><li> Aggiungi sfere magnetiche dal kit isolamento CD4 - 20 uL per 10 milioni di cellule, tubo tappo, e il luogo in ghiaccio per 15 minuti </li><li> Aggiungi dieci volumi di correre tampone per lavare e centrifugare a 230 × g per 10 minuti. </li><li> Durante la rotazione, istituito il magnete e 5 ml in tubo di polipropilene di lavoro </li><li> Aspirare il liquido da pellet, aggiungere 2 mL di tampone di corsa e rimuovere i grumi con una pipetta di trasferimento </li><li> Utilizzando la pipetta stesso trasferimento, trasferire le cellule in provetta da 5 ml ed incubare nel magnete per 15 minuti </li><li> Con attenzione decantare il CD4 + frazione di cellule in una marcata 15 ml tubo invertendo il magnete e lo svuotamento tutte ma l&#39;ultima goccia </li><li> Aggiungere altri 2 ml di esecuzione tampone nella provetta 5 ml e rimuovere dal magnete </li><li> Lavare delicatamente le cellule CD4 i lati della provetta e trasferire a una marcata tubo 15 ml </li><li> Aggiungere 2 ml di medium di cellule T ad ogni provetta, rimuovere aliquote per il conteggio delle cellule e centrifugare a 230 × g per 10 minuti. </li><li> Diluire aliquote cella con trypan blu e contare con un emocitometro. Queste conta delle cellule detterà il numero di pozzi utilizzati per la fase di espansione della cultura. </li></ol> * In alternativa, colonne e perline MACS (Miltenyi Biotec), il separatore cellulare AutoMACS (Miltenyi Biotec), o separatore cellulare Robosep (Stem Cell Technologies) può essere utilizzato in base alle istruzioni produce al posto di passi 2,2-2,11. 3. Nella cultura di espansione in vitro <ol><li> Aspirare il liquido dalla CD4 + e CD4-cell pellet e, in base alla conta delle cellule, aggiungere terreni di coltura (di solito 3 milioni CD4 + cellule per ml e 10 milioni di CD4-cellule per mL funziona bene per l&#39;impostazione della cultura). La cultura di espansione richiede 3-5000000-CD4 cellule per pozzetto e 2-3000000 CD4 + cellule per pozzetto in un volume totale di media 1 ml la cultura in un piatto ben 48 cultura. Tipicamente, le cellule CD4 + sono la popolazione limitando </li><li> Se lo si desidera, irradiare le cellule CD4 (5000 Rad<html> s). Aliquota di cellule CD4 in numero appropriato di pozzi su un piatto ben 48 con l&#39;aggiunta di 300-500 microlitri a ciascuno. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C per 1 ora. L&#39;aderente cellule CD4-servirà come cellule presentanti l&#39;antigene nella cultura di espansione. </li><li> Togliere la placca dal termostato. </li><li> Lavare i pozzetti aggiungendo 500 uL di mezzi freschi e pipettando gentilmente su e giù per 12-20 volte utilizzando una pipetta di trasferimento e la rimozione di tutto il liquido. Questo lavaggio si lascerà alle spalle uno strato di cellule che presentano l&#39;antigene aderenti. </li><li> Quando il lavaggio è completo, aggiungere media appena sufficiente a bagnare il fondo di ciascun pozzetto (circa 100 uL) - altrimenti le cellule aderenti si asciughino </li><li> Aggiungi 2-3000000 cellule CD4 + in ciascun pozzetto. Se necessario, aggiungere ulteriori mezzi per portare il volume totale di ogni bene fino a 1 ml. </li><li> Aggiungere il peptide desiderato in ogni pozzetto. La concentrazione tipico per la stimolazione è di 10 ug / mL finale. </li><li> Mettere in una piastra di 37 ° C incubatore per 7 giorni. </li><li> Dopo 7 giorni, aggiungere 50 uL di Hemogen IL-2 (o equivalente, come ricombinante IL-2, 10 IU / mL) a ciascun pozzetto. </li><li> Nei giorni successivi, monitorare la crescita delle cellule utilizzando un microscopio. Avanzamento pozzi che non sono ancora confluenti rimuovendo la metà dei mezzi di comunicazione, l&#39;aggiunta di mezzi freschi e 50 uL di IL-2. Split pozzi confluenti da risospendere le cellule, spostando la metà delle cellule di un pozzo vuoto, l&#39;aggiunta di mezzi freschi e 50 uL di IL-2. Ritorno alle cellule di incubatrice. </li><li> Le cellule in espansione sarà pronto per tetramero dopo 13-15 giorni di coltura. </li></ol> 4. Visualizzare le cellule T dalla colorazione tetramero <ol><li> Acquisto o assemblare tetrameri per abbinare le combinazioni peptide / MHC che corrispondono ai CD4 + stimolato le cellule T (vedi la discussione per le fonti di reagenti tetramero). Tetrameri dovrebbe essere ~ 0,5 mg / ml soluzione. </li><li> Rimuovere la piastra da incubatore </li><li> Con attenzione erogare la metà dei mezzi di comunicazione di ogni bene </li><li> Trasferire un&#39;aliquota di cellule da ogni pozzetto - tipicamente 75 microlitri o circa 50.000 cellule - in polistirolo 5 ml tubo FACS </li><li> Aggiungi tetramero - tipicamente 1 ml per 50 microlitri di volume totale - e il luogo in incubatore a 37 ° C per 1-2 ore. Si consiglia inoltre di macchiare un seconda aliquota di cellule di ogni bene con un tetramero non corrispondenti come controllo negativo. </li><li> Cellule etichetta con anti-CD3, anti-CD4, ed anticorpi anti-CD25 con l&#39;aggiunta di 30-10 l di ogni anticorpo. Marcatori anticorpali aggiuntivi o alternativi possono essere utilizzati. Tuttavia, non utilizzare gli anticorpi PE etichettati dal momento che questo canale deve essere riservato al tetrameri. In questo momento, anche etichetta controlli singolo colore o isotipo utilizzando cellule in più. </li><li> Incubare cellule anticorpo marcato per 15-30 minuti in ghiaccio o a 4 ° C. </li><li> Lavare ciascuna provetta con 0,5 a 2 ml in esecuzione tampone e centrifugare a 230 × g per 10 minuti. </li><li> Con attenzione liquido decantare da tubi FACS. Conservare tutti i tubi in un recipiente coperto (preferibilmente su ghiaccio) per la successiva analisi FACS. </li></ol> 5. Flusso di acquisizione e analisi Citometro <ol><li> Calibrare il citofluorimetro utilizzando perline di riferimento. </li><li> Verificare le impostazioni dello strumento: <ol><li> Utilizzando cellule di controllo senza macchia o controlli isotipo, regolare la posizione del gate linfocitario vitale (FSC vs SSC). Rimuovere l&#39;auto-fluorescenza da tutti i canali di centraggio della popolazione (modificando le impostazioni di guadagno) al di sotto del primo decennio su ogni asse. </li><li> Utilizzando solo i tubi di controllo del colore, gli eventi all&#39;interno del centro quadranti corretta per ogni singolo colore (modificando le impostazioni di compensazione). </li><li> Fare una regolazione fine delle impostazioni dello strumento utilizzando un tubo colorato con un tetramero irrilevante. In particolare le impostazioni per il canale di PE può essere necessario regolare perché spesso tetrameri macchia più luminosa del controllo degli anticorpi. Il tetramero irrilevante dovrebbe macchia &lt;0,5% delle cellule CD4 +. </li></ol></li><li> Acquisire dati per ogni tubo <ol><li> Raccogliere eventi per ogni provetta e tubo controllo negativo </li><li> Acquisire e salvare almeno 20.000 eventi per Analysys </li></ol></li><li> Analizzare i dati <ol><li> Dati importare file in software di analisi FACS (ad esempio il software CellQuest, WinMDI o FlowJo). Inizia la tua analisi utilizzando un tubo colorato con un tetramero irrilevante. </li><li> Plot FSC vs SSC e disegnare un cancello intorno i linfociti dal vivo (Figura 1, pannello in alto a sinistra). </li><li> CD4 complotto contro CD3 (gated per mostrare linfociti vivere solo) e disegnare cancelli tutto il CD3 + e CD4 + popolazioni (Figura 1 pannello in alto a destra). </li><li> CD4 plot vs tetramero (gated per mostrare linfociti CD3 + solo) e impostare i confini quadrante in modo che i CD4 + tetramero + popolazione è inferiore allo 0,5% (Figura 1 pannello in basso a sinistra). </li><li> Plot CD25 vs tetramero (gated per mostrare linfociti CD4 + solo) e impostare i confini quadrante in modo che la popolazione tetramero + CD25 + è inferiore allo 0,5% (Figura 1 pannello in basso a destra). </li><li> Analizzare tutte le provette senza cambiare le porte. </li></ol></li></ol>1167/JOVE 20FIGURE%% &quot;alt =&quot; 201.png &quot;width =&quot; Figura 1 &quot;height =&quot; 600 342 &quot;/&gt; Figura 1. Rappresentante di controllo negativo risultati della colorazione tetramero. Il pannello in alto a sinistra mostra in avanti side scatter versi dispersione e la dimensione del gate dei linfociti (R1). Il pannello in alto a destra è recintato per R1 e mostra formica-CD4 contro anti-CD3 e il CD3 + (R2) e CD4 + (R3) cancelli. Il pannello in basso a sinistra è recintato per R2 e mostra anti-CD4 rispetto al tetramero. Il pannello in basso a destra è recintato per R3 e mostra anti-CD25 contro tetramero. I quadranti di entrambe le trame tetramero sono stati fissati al 0,5%. 6. Rappresentante Risultati <ol><li> Le cellule tetramero positivo dovrebbe essere una popolazione distinta tra le cellule CD4 + espanse (Figura 2). </li><li> Cellule tetramero positivi sono di solito CD25 + CD4 e spesso elevata. </li><li> In alcuni casi, una combinazione MHC / peptide può dare la colorazione di fondo (spesso causati da un peptide con scarsa solubilità). Colorazione di fondo quali possono essere differenziati da un vero positivo perché il &quot;falso positivo&quot; le cellule non sono un unico popolo distinto sia sul CD4 rispetto tetramero o il CD25 vs trame tetramero (Figura 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362" /> Figura 2. Rappresentante positivi risultati della colorazione tetramero. Il layout del pannello e la strategia di gating sono identici alla figura 1. Le cellule tetramero positive appaiono come un popolo distinto CD4 alta sulla anti-CD4 rispetto al pannello di tetramero e una distinta popolazione CD25 + sul anti-CD25 contro pannello tetramero. <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="Figura 3" width="600" height="336" /> Figura 3. Rappresentante &quot;falsi positivi&quot; risultati della colorazione tetramero. Il layout del pannello e la strategia di gating sono identici alla figura 1. L&#39;anti-CD4 rispetto al pannello tetramero mostra una colorazione indistinta &quot;mounded&quot;. L&#39;anti-CD25 contro tetramero mostra anche una colorazione &quot;mounded&quot;, senza alcuna chiara tendenza verso l&#39;essere CD25 +.

<ol>
	<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4++T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer-guided+epitope+mapping:+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4++T+cell+epitopes+from+complex+antigens.">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li></ol>

Comprendere il ruolo delle cellule T CD4 + nel immunità è di fondamentale importanza. Tuttavia, CD4 + antigene specifico le cellule T possono essere difficili da individuare e isolare con metodi tradizionali. Al contrario, tetrameri MHC di classe II permette la visualizzazione diretta delle cellule T CD4 + con la specificità antigene desiderato. Questo video dimostra l&#39;isolamento, la purificazione e l&#39;amplificazione in vitro di cellule T CD4 + e la loro successiva visualizzazione con tetrameri. Classe II sono...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Class 2 Laminar flow biosafety cabinet</td>
<td>equipment</td>
<td>Thermo Forma</td>
<td>1200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical Tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>47747-182</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>1X PBS (Ca/Mg free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30028.02</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Ficoll-paque PLUS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1440-03</td>
<td>foil wrapped to protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipet Aid XP</td>
<td>equipment</td>
<td>Drummond</td>
<td>4-000-101</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>10 mL pipet</td>
<td>equipment</td>
<td>Corning/Costar</td>
<td>CLS4492</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Aerosolve Canisters</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>359481</td>
<td>with 50 mL inserts</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>GS-6R</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipets </td>
<td>equipment</td>
<td>Samco</td>
<td>202-20S</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>14672-200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemolytic Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6146</td>
<td>0.2% in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR </td>
<td>15170-208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>05-527-90</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-155</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>EasySep&reg; Magnet</td>
<td>equipment</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>18000</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL polypropylene tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352063</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td> Invitrogen</td>
<td>22400-089</td>
<td>with 25 mM HEPES</td>
</tr>
<tr>
<td>Pooled human serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1570-063</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>500mL 0.22 micron bottle top filter</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalgene</td>
<td>595-3320</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>48-well plate</td>
<td>equipment</td>
<td>Costar</td>
<td>3548</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>37&deg;C CO2 incubator</td>
<td>equipment</td>
<td>Sanyo Scientific</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL synthetic peptide</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Custom synthesis from any peptide vendor</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL FACS tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352008</td>
<td>Polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide loaded class II tetramer (as described)</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Prepared by the BRI tetramer core</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD3</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>347344</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD4</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>17-0049-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD25</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>11-0259-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Facs Calibur Flow Cytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>342975</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers

Complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II tetrameri consentire la visualizzazione diretta dei CD4 + antigene specifico le cellule T mediante citometria di flusso. Questo metodo si basa sulla interazione altamente specifica tra peptide caricato MHC e il corrispondente delle cellule T del recettore. Mentre l&#39;affinità di un singolo MHC / peptide molecola è bassa, il cross-linking complessi MHC / peptide con streptavidina aumenta l&#39;avidità di interazione, consentendo il loro impiego come reagenti di colorazione. A causa delle frequenze relativamente basso di cellule CD4 + T (~ 1 in 300.000 per una specificità unica) questo saggio si avvale di una fase di amplificazione in vitro di aumentare la soglia di rilevazione. Cellule mononucleate sono purificati dal sangue periferico da sottofondo Ficoll. Cellule CD4 + sono poi separati da selezione negativa utilizzando cocktail biotinilato anticorpi e perle di anticorpi anti-biotina magnetico. Utilizzando cellule aderenti dalla frazione di cellule CD4 come cellule presentanti l&#39;antigene, cellule T CD4 + sono espanse in media con l&#39;aggiunta di un peptide antigenico e IL-2. Le cellule espanse sono colorati con la corrispondente classe II tetramero di incubazione a 37 ° C per un&#39;ora e successivamente colorati con anticorpi di superficie come anti-CD4, anti-CD3 e anti-CD25. Dopo l&#39;etichettatura, le cellule possono essere analizzati direttamente mediante citometria di flusso. Le cellule tetramero positivo tipicamente formano una popolazione distinta tra le cellule CD4 + espanse. Cellule tetramero positivi sono di solito CD25 + CD4 e spesso elevata. Perché il livello di colorazione di fondo tetramero possono variare, risultati colorazione positiva deve essere sempre rispetto alla colorazione delle stesse cellule con un tetramero irrilevante. Più varianti di questo test di base sono possibili. Cellule tetramero positivi possono essere ordinati per ulteriori analisi fenotipica, l&#39;inclusione in ELISPOT o saggi di proliferazione, o altre prove secondarie. Diversi gruppi hanno anche dimostrato di co-colorazione con tetrameri e uno anti-citochine o anti-FoxP3 anticorpi.

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Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Questa procedura dimostra la purificazione e l&#39;espansione in vitro di cellule CD4 + antigene specifico le cellule T del sangue periferico da tutto e la loro visualizzazione utilizzando tetrameri MHC di classe II. Tetrameri consentire la visualizzazione diretta delle cellule T con una singola specificità antigenica e definito MHC di classe II restrizione.

CD4 + antigene specifico visualizzando cellule T con MHC di classe II tetrameri

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Research

JoVE Journal

Biology

21.6K Views.  Benaroya Research Institute. Questa procedura dimostra la purificazione e l'espansione in vitro di cellule CD4 + antigene specifico le cellule T del sangue periferico da tutto e la loro visualizzazione utilizzando tetrameri MHC di classe II. Tetrameri consentire la visualizzazione diretta delle cellule T con una singola specificità antigenica e definito MHC di classe II restrizione.

Video: Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-linfociti Capture utilizzando un chip monouso Microfluidic per l&#39;HIV

Ricerca

Biologia

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolamento di cellule T CD4 + da Linfonodi mouse utilizzando Miltenyi Purificazione MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Una tecnica di visualizzare contemporaneamente Virus specifiche cellule CD8 + T e cellule infettate da virus In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolamento di cellule endoteliali valvolare

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Cella di analisi specifica di<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Foglie usando fluorescenza activated cell sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualizzare batteri nei nematodi usando la microscopia a fluorescenza

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Un saggio di legame High Throughput MHC II per l&#39;analisi quantitativa dei peptidi epitopi

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Rilevazione di intracellulare genica in cellule vive di murini, umana e suina origine utilizzando nanoparticelle di fluorescenza marcata

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo strumenti open-source

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

Isolamento di CD4+ T-cellule e analisi della circolazione follicolare T Helper (cTfh) sottoinsiemi di cellule da sangue periferico mediante citometria a flusso di 6 colori

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...