Name: in vivo study of human endothelial-pericyte interaction using the matrix gel plug assay in mouse
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
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Dr. K. Yuan was supported by an American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) and the Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Dr. V. de Jesus Perez was supported by a career development award from the Robert Wood Johnson Foundation, an NIH K08 HL105884-01 award, a Pulmonary Hypertension Association Award, a Biomedical Research Award from the American Lung Association and a Translational Research and Applied Medicine award from Stanford University.

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Stanford University School of Medicine. NOTA: Gli animali sono sotto anestesia con il 3% isoflurano vaporizzatore e fornitura 3% di O 2 gas. L&#39;uso del veterinario pomata sugli occhi può aiutare a prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. 1. Preparazione delle cellule <ol><li> Crescere endoteliali e cellule pericyte culture umane in piastre da 100 mm con 10 ml di supporto appropriato. Sostituire 10 ml di mezzo fresco ogni 2 - 3 giorni fino cellule raggiungono l&#39;80% di confluenza. <ol><li> cellule endoteliali cultura (ECS) in supporto completo delle cellule endoteliali (ECM) integrato con la società forniti 5% di siero fetale bovino (FBS), il 10% di penicillina / streptomicina e 10% supplemento di crescita delle cellule endoteliali. </li><li> periciti cultura in mezzi pericyte completa (PM) integrato con società forniti 2% FBS, 10% di penicillina / streptomicina e 10% supplemento di crescita pericyte. </li&gt; </ol></li><li> Preparare miscele di cellule <ol><li> Calcolare il numero di cellule necessario per i gruppi trattati e di controllo. NOTA: Ogni plug nel gruppo sperimentale contiene un milione (1 x 10 6) EC umana e duecentomila (2 x 10 5) periciti. Per il gruppo di controllo, ogni spina contiene solo 1,2 milioni di EC umani. Il gruppo di controllo negativo ha solo gel matrice. Ogni gruppo deve comprendere almeno quattro spine, che richiederebbero due topi come spine possono essere iniettati in ogni lato di un topo parte bassa della schiena. Tre spine servirebbero come triplice copia per l&#39;esperimento e il quarto potrebbero essere utilizzati nel caso in cui uno non riesce. Preparare 25% in più celle in base al volume extra di gel. </li><li> Raccogliere e contare le cellule da piastre di coltura. <ol><li> Per staccare cellule, rimuovere il supporto e lavare una volta con 1x temperatura ambiente tampone fosfato salino (PBS). Rimuovere PBS, aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina / 2.21 mM EDTA e incubare per 1 min. Lavare le cellule la piastra con l&#39;aggiunta di 2medio ml e raccogliere in una provetta da 15 ml. </li><li> Conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Centrifugare il numero appropriato di celle in una pallina a 400 xg per 5 min. Per il gruppo sperimentale, centrifuga sia ECS e periciti giù insieme in un unico pellet. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Matrix Gel di Preparazione <ol><li> Scongelare gel matrice completamente a 4 ° C per 4 ore o durante la notte per ottenere una soluzione omogenea. Non è necessaria alcuna miscelazione. </li><li> Aliquota gel matrice provette da 1,5 ml e conservare a 4 ° C. </li><li> Pre-freddo sterili provette da 1,5 ml e 28 G 1 siringhe da insulina cc a 4 ° C. Attenzione: Mantenere il gel matrice sul ghiaccio in ogni momento. </li><li> Mescolare gel matrice freddo con bFGF in un rapporto volumetrico di 1: 100 (concentrazione finale di bFGF = 0,5 mg / ml; bFGF di soluzione = 50 pg / ml) Dopo miscelazione soluzione di gel matrice pipettando su e giù parecchie volte, incubare su ghiaccio per il 30 - 60 min before miscelazione con le cellule in fase 3.1. NOTA: Scongelare lo stock bFGF prima della miscelazione. Calcolare il numero di tasselli necessari per l&#39;iniezione. Per esempio, ogni plug richiede 200 gel matrice ul. Pertanto, la preparazione del 25% gel in più. </li></ol> 3. Matrix Gel Mix con cellule <ol><li> Per ogni gruppo, risospendere il pellet cellulare (contenente il numero di cella appropriata) con il volume calcolato di gel matrice contenente bFGF. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma e lasciare in tubo da 15 ml in ghiaccio fino topi sono preparati per l&#39;iniezione. </li></ol> 4. Preparazione del mouse <ol><li> Anestetizzare 1 topi SCID per 5 min a 3% isoflurano + 3% O 2 in una camera di induzione. Focus su un gruppo sperimentale, o 2 topi, alla volta. </li><li> Rimuovere il mouse dalla camera di induzione, posto su un lato ventrale piastra elettrica verso il basso e collegare rapidamente un ugello muso al volto del topo mediante un sistema non-rirespirazione per la fornitura di anestesia in tutto il InjeProcedura ction. Passare il flusso di gas dalla camera di induzione al sistema antireflusso e abbassare la pressione del gas al 1,5% isoflurano e 1,5% O 2. </li><li> Rimuovere i capelli da entrambe le regioni posteriori laterali (circa 1 cm di diametro) con una crema di rimozione rasoio o dei capelli. </li><li> Pulire la zona della pelle con un tampone imbevuto di alcool al 70%. </li><li> Ritorna il mouse per la camera di induzione e ripetere i passaggi 4,2-4,4 con il secondo mouse. </li></ol> 5. Matrix Gel iniezione <ol><li> Preparare un mouse per l&#39;iniezione collegando al sistema di non-rirespirazione e l&#39;immissione sul lato ventrale rilievo di riscaldamento verso il basso. </li><li> Caricare il gel matrice in un pre-raffreddata 28 G 1 cc siringa di insulina un mouse alla volta. <ol><li> Caricare il completo volume di 500 ml di gel di matrice per due tasselli (200 pl per alveolo più il 25% in più) nella siringa. </li><li> Assicurarsi di iniettare il gel matrice nei topi nel raggio di 3 min di caricare le cellule nella siringa per evitare che il ceLLS da stabilirsi al lato della siringa ed evitare gel matrice solidifichi all&#39;interno della siringa. </li></ol></li><li> Sollevare la pelle torna per individuare lo spazio sottocutaneo, quindi iniettare 200 ml di gel di matrice lentamente e in modo uniforme nello spazio sottocutaneo del posteriore posteriore della gabbia toracica. </li><li> Rimuovere l&#39;ago per l&#39;iniezione lentamente, facendo attenzione a evitare che il gel matrice fuoriuscita del sito di iniezione. Un urto formerà nel sito di iniezione. Pulire sito di iniezione con un tampone di alcool. </li><li> iniezione Ripetere i passi 5.2 - 5.5 dall&#39;altra parte posteriore del mouse, quindi lasciare il mouse sul retro per 1 min per consentire gelificazione del gel matrice sul cuscino termico. </li><li> Outline entrambi urti con un pennarello indelebile per identificare l&#39;urto dopo 14 giorni. Dopo un po &#39;i capelli ricrescono, sarà più facile trovare l&#39;urto. </li></ol> 6. Matrix Isolamento Gel Plug: 14 giorni dopo l&#39;iniezione <ol><li> Euthanize i topi umanamente esponendo l&#39;animales per&gt; 5 min di inalazione di anidride carbonica seguita da dislocazione cervicale per assicurare la morte. </li><li> Togliere il tappo di gel di matrice dalla schiena del mouse. <ol><li> Rimuovere delicatamente i capelli ricresciuti intorno al sito di iniezione in cui la spina si trova ripetendo il passaggio 4.3. La linea di riferimento indica la dimensione di urto originale sotto la pelle. </li><li> Asportare il tappo insieme con la pelle ei muscoli circostanti strati attaccati ai lati superiore e inferiore della spina, rispettivamente. <ol><li> Utilizzando le forbici chirurgiche sottili, effettuare un&#39;incisione sul marcato confine della spina che è perpendicolare alla pelle e tagliare al muscolo sotto il tappo. Poi, accuratamente tagliato intorno alla periferia del tappo lungo il confine marcato. </li><li> Togliere il tappo, mantenendolo inserita tra gli strati della pelle e dei muscoli. Sciacquare immediatamente in un piccolo bicchiere con 1x PBS per lavare via il sangue in eccesso. La spina è ora pronta per essere fissata (passo successivo, 6.3). </li></ol></li></ol></li><li> Fissare le plug in 4% paraformaldeide. <ol><li> Inserire l&#39;intera spina, compresi gli strati cutanei e muscolari, in un tubo da 50 ml con 25 ml di paraformaldeide al 4% per 24 ore a temperatura ambiente senza dondolo. Il giorno successivo, trasferire la spina in 25 ml di etanolo al 70% per un altro 24 ore prima di paraffina. NOTA: maneggiare con cautela paraformaldeide. Indossare i guanti. </li></ol></li></ol> 7. Processo di paraffina Matrix Gel Plug <ol><li> Preparare la spina per paraffina. <ol><li> Orientare la spina come mostrato in figura 1a; inserire la spina in una cassetta tessuto in modo che il lato del tappo rivolto verso l&#39;alto ed entrambi gli strati di pelle e muscolari sono visibili attraverso la superficie del blocco di tessuto che verrà tagliato prima durante il sezionamento. </li></ol></li><li> Paraffina incorporare la spina secondo i protocolli standard di paraffina 13. </li><li> Tagliare 8 - 10 micron sezioni spesse fuori del blocco dei tessuti e montare su vetrini da microscopio according ai protocolli standard di paraffina sezionamento 13. </li><li> Conservare i vetrini in un luogo fresco e asciutto a temperatura ambiente fino al momento per la colorazione. </li></ol> 8. Le sezioni macchia con ematossilina e eosina (H &amp; E) 13 <ol><li> Sparaffinare le sezioni di tessuto passando le diapositive attraverso 100% xilene due volte, 100% di etanolo, 95% di etanolo, 70% di etanolo ed infine 1x PBS, ciascuno per 5 min a temperatura ambiente. Lasciare i vetrini in PBS 1x fino al passo successivo. </li><li> Dispensare 100 ul H &amp; E soluzione sulla sezione e incubare per 1-5 minuti, o fino a quando non vi è chiaro contrasto tra i nuclei blu e rosa citoplasma in una cella come visto sotto un microscopio ottico verticale a 10X di ingrandimento. Fare attenzione a non lasciare alcuna soluzione H &amp; E toccare l&#39;obiettivo. </li><li> Lavare H &amp; E soluzione al largo della slitta da inzuppare il vetrino in un grande bicchiere di acqua di rubinetto, quindi inserire la diapositiva in un rack nel bicchiere e sciacquare con acqua corrente per 2 minuti. </li><li> momentove al punto 9.8 per montare le diapositive. </li></ol> 9. Stain altre diapositive per Capillari umani e periciti <ol><li> Sparaffinare le sezioni di tessuto passando le diapositive attraverso 100% xilene due volte, 100% di etanolo, 95% di etanolo, 70% di etanolo ed infine 1x PBS, ciascuno per 5 min a temperatura ambiente. Lasciare i vetrini in PBS 1x fino al passo successivo. </li><li> Lessare le sezioni in soluzione di antigene di recupero. <ol><li> In un becher 2 L, preparare antigene soluzione bollente recupero utilizzando 1x tampone citrato (pH 7,0) a 95 ° C su una piastra riscaldante. </li><li> Una volta ebollizione, mettere i vetrini in un rack di metallo e immergere nella soluzione di recupero dell&#39;antigene bollente per 20 minuti. </li><li> Rimuovere con cautela il bicchiere dal blocco di riscaldamento con gli scivoli ancora sommerse e consentire la soluzione per tornare lentamente a temperatura ambiente per circa 30 min. </li><li> Porre i vetrini in PBS 1x fino al prossimo passo. </li></ol></li><li> Bloccare le sezioni in tampone di bloccaggio (1x PBS, 5% di siero di capra, 0.3% Triton X-100). <ol><li> Disegnare un cerchio idrofobico intorno ai bordi di ciascuna sezione con una penna PAP. </li><li> Porre i vetrini in un vassoio di umidità con acqua distillata sul fondo del vassoio. </li><li> Dispensare 100 microlitri tampone di bloccaggio sulle sezioni assicurandosi tutto il tessuto è coperto da fluido (può richiedere più di 100 ml). </li><li> Incubare sezioni con tampone di arresto per 1 ora. </li></ol></li><li> Incubare sezioni con anticorpo primario. <ol><li> Preparare una soluzione con due anticorpi primari per sondare ogni sezione per CD31 (ECS) e actina muscolo liscio (periciti) diluito in tampone di diluizione (1x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100). NOTA: Qui, la concentrazione di anti-CD31 è 01:50 e anti-liscia concentrazione actina muscolo è 1: 300. </li><li> Incubare sezioni notte a 4 ° C con 100 microlitri anticorpi primari in un vassoio di umidità contenente acqua distillata. </li></ol></li><li> Lavare i vetrini tre volte in 1x PBST (1x PBS + 0,1% TweEN20) per 5 minuti ogni lavaggio. </li><li> Incubare sezioni con anticorpo secondario. <ol><li> Preparare una soluzione con una capra coniugato anticorpo secondario anti-coniglio fluoroforo per riconoscere l&#39;anticorpo di coniglio anti-CD31 diluito in tampone di diluizione. <ol><li> NOTA: L&#39;anticorpo primario actina muscolo liscio è già coniugato con un fluoroforo CY3, quindi non è necessaria alcuna colorazione anticorpo secondario. Capra anti-coniglio concentrazione di anticorpi secondario è 1: 250. </li></ol></li><li> Incubare sezioni per 1 ora con 100 microlitri anticorpo secondario nel vassoio di umidità contenente acqua distillata. </li></ol></li><li> Lavare i vetrini tre volte in 1x PBST per 5 minuti ogni lavaggio. </li><li> Montare le diapositive. <ol><li> Pipettare 2 - 3 gocce (~ 40 - 60 microlitri) di antifade soluzione di montaggio con colorazione DAPI nucleare su ogni sezione. </li><li> Posizionare delicatamente un no. 1.5 coprioggetto sopra le sezioni e soluzione di montaggio, permettendo al fluido distribuito su sezioni e ai bordila polizza di copertura. usare delicatamente un dito per premere le bolle d&#39;aria che possono essere situati sulla sezione. </li><li> Lasciate che le diapositive asciugare per almeno 1 ora prima dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 10. Quantificare capillare densità e struttura 14 <ol><li> Contare il numero di capillari in H &amp; E sezioni colorate, espressa in # / mm 2. <ol><li> Acquisire le foto di quattro diversi campi su un microscopio ottico in posizione verticale sotto 40X di ingrandimento. NOTA: Capillari sono identificati come tubi riempiti di globuli rossi. </li><li> In alternativa, invece di capillari conteggio manualmente, utilizzare un&#39;immagine software di analisi (ad esempio, Wimasis Image Analysis) quantificare diversi parametri angiogenesi come il numero nave, lunghezza media nave e diametro, e punti di ramificazione. </li></ol></li><li> Analizzare struttura capillare nelle sezioni di immunofluorescenza macchiato. <ol><li> Acquisire le foto di quattro diversi campi su un microscopio a fluorescenza invertitocon il cubo filtro FITC e TxRed. <ol><li> Utilizzare un cubo FITC di immagine EC da eccitazione a 488 nm di lunghezza d&#39;onda e utilizzare un cubo TxRed di periciti immagine da eccitazione a 594 nm di lunghezza d&#39;onda. <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
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Il saggio spina gel matrice ha dimostrato di essere un metodo comodo e potente per valutare regolazione genica nell&#39;angiogenesi, composti angiogenici e antiangiogenici in vivo, e per integrare test in vitro. Qui, descriviamo in dettaglio un romanzo spina saggio gel matrice dell&#39;angiogenesi umana che indaga l&#39;interazione tra cellule endoteliali e periciti durante la formazione dei vasi. Ci sono alcuni punti nuovi e critici in questo protocollo. Le cellule in bass...

L&#39;angiogenesi è il processo attraverso il quale nuovi vasi sanguigni si formano da una rete vascolare preesistente 1 ed è il centro di ricerca in corso in molti settori che vanno dallo sviluppo normale alla malattia. Questo processo dinamico coinvolge la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali (EC) e reclutamento di periciti per costruire un tubo vascolare rivolta verso il sito che ha bisogno di ossigeno e nutrienti consegna 2. Per studiare questo processo richiede un saggio altrettanto dinamico, soprattutto uno che può riassumere la natura tridimensionale di formazione del tubo. In vitro matrice 3D sono state sviluppate per rispondere a questa esigenza e hanno lavorato bene per consentire ai ricercatori di definire i passi discreti nello spazio e nel tempo in cui si svolge l&#39;angiogenesi 3, 4, 5, 6. Tuttavia, questi modelli di matrici in vitro 3D sono limitati a studiare i vasi non perfuso und pertanto mancano componenti critici pertinenti al processo di angiogenesi (ad esempio, la crescita e fattori inibitori, tensione innaturale / forze che circola attraverso il letto vascolare) e non riescono a simulare l&#39;ambiente complesso presente nel tessuto vivo. Per far fronte a questa limitazione, diversi saggi di angiogenesi in vivo sono stati sviluppati 7, tra cui il saggio spina gel matrice che sarà al centro della nostra relazione 8, 9. Il saggio spina gel matrice è un vivo test consolidata nell&#39;angiogenesi che fa appello a ricercatori in quanto fornisce una solida piattaforma per testare i ruoli delle diverse cellule e sostanze nell&#39;angiogenesi. Gel Matrix è una soluzione membrana basale disponibile in commercio che viene secreto dalla linea cellulare del mouse sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) che si solidifica in un materiale simile a gel a 37 ° C. Il gel matrice può essere miscelata con cellule e / o sostanze, quali fattori di crescita, e injeCTED per via sottocutanea nel mouse. L&#39;host EC invaderà la spina più di 14 giorni, formare una rete vascolare, e diventare perfusi con sangue dell&#39;ospite. Fino ad oggi, le analisi dei plug gel matrice si sono concentrati esclusivamente sullo studio del comportamento delle cellule endoteliali durante l&#39;angiogenesi, tuttavia, al meglio delle nostre conoscenze nessuno sforzo è stato ancora fatto per determinare se questo test può essere utilizzato cellule endoteliali di co-coltura e periciti per studiare come questi due tipi di cellule interagiscono durante l&#39;angiogenesi. In particolare, la comprensione del rapporto tra EC e periciti è prezioso per lo studio di malattie in cui la perdita dei vasi sanguigni è patologico, tra cui l&#39;ischemia microvascolare e malattia vascolare periferica 10, 11, 12. Qui, descriviamo un protocollo che introduce periciti di derivazione umana alla miscela di gel matrice con EC umana e il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF). Questa miscela può essere iniettata per via sottocutanea in dorso di topi SCID per consentire la formazione di, rivestito periciti, vasi ibridi completamente funzionale. Il nostro protocollo descrive come preparare i tappi di gel matrice contenente cellule endoteliali umane con o senza periciti umani, il posizionamento in topi SCID e come analizzare le sezioni istologiche per gli endpoint angiogenesi critici.

<table><tbody><tr><td>PBS (Phosphate buffered saline)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Media (ECM) kit</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td></tr><tr><td>Pericyte Media (PM) kit</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td>includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td></tr><tr><td>primary human pulmonary microvascular endothelial cells</td><td>Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td><td></td><td>this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4</td></tr><tr><td>primary human pulmonary pericytes</td><td>Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td><td></td><td>this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.&amp;nbsp; Cells used at passage 1-4</td></tr><tr><td>bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>stock solution is 50 &amp;mu;g/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 &amp;mu;l and stored at -20 degrees</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 cc Insluin Syringe</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age</td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 ml screw top tubes, sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Nair hair removal cream</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD31 primary antibody</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B4737</td><td>working solution is 1:50</td></tr><tr><td>anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>working solution is 1:300</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>working solution is 1:250</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI solution</td><td>Cell Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>no. 1.5 cover slips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>citrate buffer 10x</td><td>Millipore</td><td>21545</td><td></td></tr><tr><td>extra fine surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Formalin (paraformaldehyde)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>Tissue cassettes</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo study of human endothelial-pericyte interaction using the matrix gel plug assay in mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Rappresentante H &amp; E e immunofluorescenza colorazione di sezioni spina gel matrice sono mostrati in Figura 2. Sezioni dalla CE solo spine mostrano alcune navi che non sono per lo più perfusi con il sangue (figura 2 in alto a sinistra, frecce nere), mentre le spine contenenti sia EC e periciti visualizzare diverse perfuso navi con diametri maggiori e copertura pericyte completo, come dimostra positivo SMA colorazione immediatamente adiacente alla EC ...

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In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Vi presentiamo un protocollo per studiare le interazioni umane endoteliali-periciti in mouse utilizzando una variazione del saggio spina angiogenesi gel matrice.

Studio in vivo di Human Interaction endoteliale-pericyte Utilizzando la matrice di gel Plug Assay nel topo

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

9.6K Views.  Stanford University.  Vi presentiamo un protocollo per studiare le interazioni umane endoteliali-periciti in mouse utilizzando una variazione del saggio spina angiogenesi gel matrice. 

Video: In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Test per la verifica della nave Permeabilità Sangue

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Ricerca

Medicina

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio Attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Immunologia e infezioni

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including embryogenesis and development, wound healing, tumor growth and metastasis, and ocular and cardiovascular diseases. Effective in vitro models that recapitulate the biology of angiogenesis are needed to appropriately study this process and identify mechanisms of regulation that can be ultimately targeted for novel therapeutic strategies. The bead angiogenesis assay has been previously demonstrated to recapitulate the multiple stages of endothelial sprouting in vitro. However, a limitation of this assay is a lack of endothelial &#8211; mural cell interactions, which are key to the molecular and phenotypic regulation of endothelial cell function in vivo. The protocol given here presents a methodology for the incorporation of mural cells into the bead angiogenesis assay and demonstrates a tight association of endothelial cells and pericytes during sprouting in vitro. The protocol also details a methodology for effective silencing of target genes using siRNA in endothelial cells for mechanistic studies. Altogether, this protocol provides an in vitro assay that more appropriately models the diverse cell types involved in sprouting angiogenesis, and provides a more physiologically-relevant platform for therapeutic assessment and novel discovery of mechanisms of angiogenesis regulation.

This protocol presents a novel in vitro bead assay that more appropriately models the process of in vivo sprouting angiogenesis by incorporating pericytes. This modification enables the bead assay to more faithfully recapitulate the heterotypic cellular interactions between endothelial cells and mural cells that are critical for angiogenesis.

Incorporare i periciti un tallone di cellule endoteliali Assay di germogliatura

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Biologia dello sviluppo

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

Il corneale MICROPOCKET Assay: Un modello di angiogenesi nel Eye mouse

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Neuroscienze

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Strategico cellule endoteliali tubo saggio Formazione: Confronto tra matrice extracellulare e fattore di crescita ridotto matrice extracellulare

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

Bioingegneria reti umane in topi immunodeficienti microvascolari

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Biologia

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

In vitro dosaggi per valutare la formazione e la rottura del vaso come la barriera emato-cerebrale

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired factors are introduced into cold-liquid ECM-mimic gel which, after subcutaneous injection, solidifies to form an environment mimicking the cancer milieu. This matrix permits the penetration of host cells, such as endothelial cells, and therefore, the formation of vasculature.
Herein we propose a new modified matrigel plug assay, which can be exploited to illustrate the angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells, as opposed to a specific factor (e.g., bFGF and VEGF) or agent. The plug containing ECM-mimic gel is utilized to introduce the host (i.e., mouse) with a pool of factors secreted to the C.M. of fast-growing tumor-generating glioblastoma cells. We have previously described an extensive comparison of the angiogenic potential of U-87 MG human glioblastoma and its dormant-derived clone, in this system model, showing induced angiogenesis in the U-87 MG parental cells. The C.M. is prepared by filtering collected media from confluent tissue culture plates of either cell line following 48 hr incubation. Hence, it contains only factors secreted by the cells, without the cells themselves. Described here is the combination of two imaging modalities, microbubbles contrast-enhanced ultrasound imaging and intravital fibered-confocal endomicroscopy, for an accurate, real-time characterization of the extent, morphology and functionality of newly-formed blood vessels within the plugs.

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Funzionalità di monitoraggio e di Morfologia Vasculature Reclutato da fattori secreti dalle cellule a crescita rapida, la generazione di tumore

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for phenotypic drug discovery (PDD) programs. Although these novel devices could predict the safety and efficacy of investigational drugs in humans more accurately, their development to the clinic still strongly rely on mammalian data, notably the use of mouse disease models. In parallel to human organoid or organ-on-chip disease models, the development of relevant in vitro mouse models is therefore an unmet need for evaluating direct drug efficacy and safety comparisons between species and in vivo and in vitro conditions. Here, a vascular sprouting assay that utilizes mouse embryonic stem cells differentiated into embryoid bodies (EBs) is described. Vascularized EBs cultured onto 3D-collagen gel develop new blood vessels that expand, a process called sprouting angiogenesis. This model recapitulates key features of in vivo sprouting angiogenesis-formation of blood vessels from a pre-existing vascular network-including endothelial tip cell selection, endothelial cell migration and proliferation, cell guidance, tube formation, and mural cell recruitment. It is amenable to screening for drugs and genes modulating angiogenesis and shows similarities with recently described three-dimensional (3D) vascular assays based on human iPSC technologies.

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

This assay utilizes mouse embryonic stem cells differentiated into embryoid bodies cultured in 3D-collagen gel to analyze the biological processes that control sprouting angiogenesis in vitro. The technique can be applied for testing drugs, modeling diseases, and for studying specific genes in the context of deletions that are embryonically lethal.

In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

Semplificazione degli studi di angiogenesi con un test Matrix Gel Plug

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

Autore in primo piano: Studio dell'angiogenesi e della permeabilità dei vasi attraverso un saggio di tappo in gel a matrice modificata

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

Saggio modificato in vivo del gel plug della matrice per gli studi sull'angiogenesi

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

Studio in vivo di Human Interaction endoteliale-pericyte Utilizzando la matrice di gel Plug Assay nel topo

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