Ringraziamo Drs. Arata Tabuchi e Wolfgang Kuebler (Università di Toronto) per l&#39;istruzione per quanto riguarda la microscopia intravitale. Ringraziamo Andrew Cahill (Nikon Instruments) per l&#39;assistenza nella progettazione e realizzazione di microscopia. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH / NHLBI concede P30 HL101295 e K08 HL105538 (per EPS).

1. Preparazione dei tubi chirurgici, cateteri vascolari, Muro Finestra Busto <ol><li> Fase di microscopia intravitale. Abbiamo misura una fase in plexiglass su cui si trova il mouse anestetizzato durante la microscopia. Questo stadio ospita sia di 15 cm per 10 scheda di plastica flessibile di taglio cm (su cui il mouse si trova durante l&#39;induzione dell&#39;anestesia, il posizionamento tracheostomia, e cateterismo venoso), così come un elemento riscaldante di dimensioni analoghe (che si trova sotto il tagliere). </li><li> Mouse toracostomia preparazione tubo (Figura 1). A 10 cm di lunghezza del tubo PE 50 (Intramedic, diametro interno 0,58 millimetri, diametro esterno 0,965 millimetri), è tagliato. Un&#39;estremità è fissata all&#39;estremità di una curva smussata 23 gauge, questo ago verrà utilizzato per passare il tubo attraverso la parete toracica (interno → esterno) prima della chiusura della finestra toracica. L&#39;estremità distale del tubo (1,5 cm di lunghezza, di fronte agli annessi 23 gaugeago) viene ripetutamente perforato con un ago calibro 30, la creazione di &quot;porte laterali&quot; per facilitare l&#39;aspirazione efficace di aria intratoracica. Questa porzione fenestrata viene poi separato dal resto del tubo da diversi anelli circonferenziali di sutura di seta 04:00; queste anse servirà come un &quot;tappo&quot;, infine ancorando i 1,5 centimetri fenestrated porzione all&#39;interno della cavità toracica. </li><li> Cateteri venosi giugulare. Due lunghezze di 15 cm di tubi PE 10 (Intramedic, diametro interno 0.28 mm, diametro esterno 0,61 millimetri), sono tagliati. Un bisturi viene utilizzato per smussare le estremità del tubo, aumentando così la facilità di venipuntura. Il tubo viene lavata con una siringa da 1 ml contenente 6% soluzione di 150 kDa destrano (in PBS) attaccato al non smussato estremità della tubazione. </li><li> Busto preparazione finestra, parete, (Figura 2). Trasparente membrana di polivinilidene (New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) viene tagliato in una forma ovale (asse maggiore 6 cm, minori asse 4 cm). Una circolare 5 # 1 coprioggetto (Bellco) è fissato alla membrana con α-cianoacrilato colla (Pattex flüssig, Henkel, Düsseldorf). </li><li> . Tubo per induzione pneumotorace (&quot;blow tube&quot;) A 10 cm di lunghezza di tubo (diametro interno 3 mm, diametro esterno 5 mm) è attaccato ad una siringa da 5 ml, all&#39;estremità opposta sarà utilizzato per introdurre aria nella gabbia toracica animale prima di attecchimento finestra parete toracica. </li><li> Siringa per immersione in acqua di obiettivo. A 23 gauge è collegato a una siringa di 30 ml contenente acqua distillata. La punta dell&#39;ago è smussata (utilizzando un file di metallo) per evitare di danneggiare l&#39;obiettivo. </li></ol> 2. Anestesia mouse <ol><li> Un topo è anestetizzato con una miscela di ketamina (10 mg / ml) e xilazina (2 mg / ml), intraperitoneale somministrato alla dose di 8 microlitri per grammo di peso corporeo del mouse. Sedazione avviene entro 3 - 6 minuti e non dovrebbe ostacolare la respirazione spontanea. </li><li> L&#39;utilizzo di un rasoio elettrico, la barbala gola, torace, addome, e la parte destra del mouse. </li><li> Con del nastro, fissare il mouse per una scheda di taglio di plastica sottile. La testa del mouse deve essere rivolto verso l&#39;operatore (Figura 3). Leggera tensione fornita da un anello di sutura passa sotto i denti superiori serve a mantenere l&#39;estensione testa. Il tagliere è posto su di una piastra elettrica, mantenendo euthermia mouse durante tracheostomia e il posizionamento del catetere venoso. </li><li> Wet zone rasate con il 100% di etanolo. </li><li> Confermare l&#39;anestesia adeguata con una coda / zampa pizzico. Procedere se risposta minima, fornire un bolo extra di ketamina / xilazina se non adeguatamente anestetizzato. </li></ol> 3. Tracheostomia <ol><li> A 1 centimetro incisione è fatta sulla gola. Sottostante tessuto connettivo è sezionato, e le ghiandole salivari sono separati e riflessi lateralmente. Il muscolo sterno-ioideo immediatamente anteriore alla trachea viene asportato. </li><li> Un ciclo di sutura 04:00 è avanzata in the trachea (Figura 4). Il ciclo viene poi tagliato, creando due filoni separati di sutura sottostanti la trachea. La sutura caudale sarà utilizzato per fissare la cannula, la sutura cranica sarà utilizzato per fornire la tensione sulla trachea durante il posizionamento tracheostomia. </li><li> Usando due dita, la sutura superiore è afferrata e leggera tensione viene applicata alla trachea. Una incisione orizzontale è realizzata nella trachea tra superiore e inferiore suture. Questa incisione dovrebbe attraversare circa due terzi della circonferenza tracheale. Una cannula flangiato (Harvard Apparatus, 1,22 mm di diametro esterno) viene inserito nella trachea distale e fissato in posizione utilizzando la sutura caudale tracheale. </li><li> La tracheostomia è collegato ad un volume controllato ventilatore piccolo animale (Inspira, Harvard Apparatus), e il topo è ventilato con 40% di ossigeno inspirato e 9 ml / kg volumi correnti (impostazioni ottimizzate per mantenere un&#39;adeguata ossigenazione / aerazione nel nostro laboratorio). Posizione pressione di fine espirazione (PEEP) non è iniziata a questo punto. Da notare che le impostazioni del ventilatore dovrebbe essere ottimizzato per condizioni uniche in singoli laboratori. Diverse lunghezze dei tubi ridondanti (interposto tra il tubo del ventilatore connettore a Y e tracheostomia) possono essere utilizzati per regolare lo spazio morto, assicurando stabile ventilazione alveolare per qualsiasi volume scelto marea. </li></ol> 4. Cateterismo venoso <ol><li> La giunzione della vena giugulare interna ed esterna può essere identificato da inseguimento rami venosi distali prossimalmente. La giugulare esterna si trova sotto le ghiandole salivari riflettono, che può essere fatta prossimalmente per trovare l&#39;esterna-interna di giunzione giugulare. </li><li> Utilizzare dolce smussa per separare il bivio giugulare dal circostante tessuto connettivo. </li><li> Utilizzando suture 04:00, legare le vene giugulari esterne e interne giugulari distali (craniale) fino al bivio giugulare. </li><li> Fai una piccola incisione nella carenadella giunzione giugulare, sanguinamento dovrebbe essere minimo. </li><li> Due cateteri possono essere gradualmente avanzare attraverso l&#39;incisione e nel tronco giugulare. Dopo l&#39;aspirazione delicata per assicurare il ritorno del sangue, cateteri sono fissati all&#39;interno della vena con suture 04:00. </li><li> Tape cateteri venosi al tagliere per evitare contro dislocazione accidentale. </li></ol> 5. Intravitale mouse Microscopia chirurgia polmonare (adattato da Tabuchi et al. 18) <ol><li> La scheda di taglio (che contiene il contenuto, il mouse anestetizzato e cateteri venosi registrate) è transizione alla fase di microscopia intravitale, dove gli interventi chirurgici rimanenti verrà eseguita. Una sonda di temperatura rettale è posto; questa interfaccia con un sistema di riscaldamento adattativo (che si trova sotto il tagliere), che permette la manutenzione di euthermia mouse. </li><li> Un catetere venoso giugulare è collegato a una pompa a siringa che fornisce un ketamina (10 mg / ml)-xilazina (2 mg / ml)miscela a 200 pl per ora. Anestesia adeguata è ancora una volta confermata con coda / zampa pizzico. </li><li> L&#39;incisione mediana si estende dal collo al processo xifoideo, procedendo poi lateralmente a destra (Figura 5). </li><li> Utilizzando elettrocauterizzazione, la muscolatura del torace viene rimosso, esponendo la gabbia toracica. La cura è presa per garantire l&#39;emostasi completa. </li><li> Attraversare gamba posteriore destro del mouse sul lato sinistro e il nastro verso il basso. La torsione risultante addominale ruota il torace leggermente, migliorando la facilità della chirurgia. </li><li> Luogo la fase ad un angolo di 45 gradi (figura 6); questo posizionamento permette il polmone ad allontanarsi dalla parete toracica volta il pneumotorace è indotta. </li><li> Il 1 ° costola (costola più inferiore) si afferra con una pinza e cresciuto, una pinza curva è senza mezzi termini spinto sotto la costola. Questo separa pleura parietale dalla parete toracica. La pleura deve restare unpunctured. </li><li> Utilizzando il tubo di colpo euna siringa, l&#39;aria viene forzatamente introdotta contro la pleura parietale. Questo porta alla rottura della superficie pleurica pneumotorace e senza danneggiare il polmone sottostante. Il polmone sottostante cadere dalla parete toracica, che consentiva l&#39;introduzione di una pinza elettrocauterizzazione senza danneggiare il polmone. Una diminuzione del volume corrente ventilatore non è tipicamente richiesto durante questa fase. </li><li> Utilizzando pinze elettrocauterizzazione, sezionare la muscolatura della parete toracica e tagliare attraverso il 5 ° e 6 ° / nervature pleura parietale, facendo da 8 mm ~ foro circolare nella parete toracica. È essenziale che completa emostasi essere mantenuta, come la presenza di sanguinamento oscurerà microscopia (Figura 7). </li><li> Utilizzando un driver ago, inserire il tubo nel foro toracostomia parete toracica. L&#39;ago deve forare la parete toracica e uscire dalla cavità toracica inferiore e laterale della finestra toracica (Figura 7). Fare attenzione a non pungere la membrana. Iltubo viene quindi delicatamente tirato fuori dalla parete toracica finché non si verifica una resistenza da &quot;tappo&quot; sutura situato sul bordo della porzione fenestrata del tubo. </li><li> Posizionare la fase piatta. </li><li> Aggiungere 3 cm H 2 O PEEP al ventilatore per aiutare assistere riespansione del polmone. </li><li> Colla (Pattex gel, Henkel) è posto attorno alla circonferenza della finestra torace. La membrana è collegato, con il vetrino coprioggetti vetro rivolta verso l&#39;esterno alla cavità toracica. Attenzione (e circonferenzialmente) circa la membrana alla colla usando un applicatore di cotone. </li><li> Durante l&#39;esecuzione di una manovra di reclutamento polmonare (3 volumi correnti durante il quale la porta è ostruita ventilatore PEEP), -3 mmHg aspirazione viene applicato al tubo toracico. Il polmone deve costantemente approssimativa della membrana, mentre liberi di muoversi durante la ventilazione di marea (Figura 8). </li><li> La zampa anteriore destra del mouse è passati al lato sinistro, con un conseguente decubito laterale sinistro del mouse.Cunei spugna può essere utilizzata per posizionare correttamente il mouse così la finestra torace è allineato con l&#39;obiettivo ad immersione microscopia acqua. </li><li> Acqua distillata è posto sul vetrino prima microscopia, permettendo la visualizzazione del polmone utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua. Acqua dovrà essere rifornito intermittente durante l&#39;imaging. </li></ol> 6. Misura dello spessore polmonare endoteliale strato superficiale <ol><li> Immediatamente dopo la chiusura della parete toracica, 500 pl FITC-destrano marcato 150 kDa (6% in soluzione di PBS) è somministrato attraverso il secondo (non anestesia) catetere venoso giugulare. Questo serve come bolo rianimazione volume e il tracciante vascolare per ESL misurazione. Il bolo destrano non influenza l&#39;adesione dei neutrofili o edema polmonare formazione 2. </li><li> L&#39;obiettivo immersione in acqua è centrato sul vetrino. La scelta di un obiettivo essenziale-per visualizzare piccole differenze di spessore ESL, un alto Numerical diaframma è necessaria (&gt; 0,8) pur mantenendo un 2-3 mm di distanza di lavoro (che consente la penetrazione attraverso la finestra polmone e superficie pleurica). Usiamo il Tribunale di primo grado 75 Nikon LWD 16x (NA 0,8) e Tribunale di primo grado 75 LWD 25x (NA 1.1) gli obiettivi per questo scopo. </li><li> Per misurare con precisione lo spessore ESL in un organo in movimento, è essenziale che chiaro e fluorescenti larghezze vascolari sono eseguite simultaneamente. Ciò può essere realizzato utilizzando una immagine splitter (Dual View, fotometrici) che consente la cattura simultanea di luce riflessa contrasto di interferenza differenziale (DIC, campo chiaro) e le immagini FITC (Figura 9). </li><li> Durante una pausa 5 sec inspiratoria, imaging continuo viene eseguito e registrato. Più tardi, queste immagini possono essere riviste per individuare in-frame di messa a fuoco. </li><li> L&#39;utilizzo di un telaio di messa a fuoco, subpleurica microvasi (&lt;20 micron di diametro) sono identificati; almeno 3 microvasi si trovano tipicamente in un unico telaio. Dopo il completamento dell&#39;esperimento, DICe FITC-destrano larghezze vascolari sono misurate (da un osservatore cieco) facendo la media delle lunghezze di tre intercettazioni perpendicolari al microvascolare. Supponendo uguale spessore ESL su entrambi i bordi della nave, la dimensione ESL può essere definita da una metà della differenza tra DIC e FITC-destrano larghezze vascolari, come descritto nella sezione rappresentativa Risultati. </li><li> In genere, la microscopia intravitale può essere eseguita per&gt; 90 min senza alcuna prova di danno polmonare o ipotensione 2. Esperimenti preliminari vanno eseguite per confermare la stabilità del mouse (pressione sanguigna, ossigenazione, ventilazione, danno polmonare) durante il periodo di osservazione. Farmaci sperimentali può essere introdotto attraverso il secondo (non-anestetico) giugulare catetere in qualsiasi momento durante la procedura. </li></ol> 7. Misura alternativa della integrità endoteliale polmonare strato superficiale Le intatte endoteliali funzioni di strato di superficie (in parte) per escludere cirelementi zione del 2 di superficie endoteliale. Integrità ESL può quindi essere misurata la capacità di un elemento circolare (ad esempio una microsfera fluorescente) per accedere e interagire con molecole di adesione sulla superficie cellulare (come ICAM-1). <ol><li> Anti-ICAM-1 etichetta microsfere fluorescenti sono preparato prima dell&#39;intervento chirurgico. Streptavidina rivestite 0,97 micron microsfere fluorescenti sono incubati con controllo biotinilato anti-ICAM-1 (YN1/1.7.4 clone, 01:50, eBioscience) isotipo dell&#39;anticorpo o per 30 min a temperatura ambiente. Le microsfere vengono lavate tre volte in PBS e sospese a 1 x 10 9 microsfere per ml. </li><li> Durante microscopia intravitale, la sospensione di microsfere (100 microlitri) viene iniettato nel catetere venoso giugulare. Dopo 15 min di circolazione, immagini fluorescenti vengono catturate oltre 5 min. Immobile per&gt; 5 min Microsfere sono considerati aderenti e quantificate utilizzando un software di elaborazione delle immagini. </li></ol> 8. Eutanasia &lt;p class =&gt; &quot;jove_content&quot; Dopo completamento della procedura, topi anestetizzati sono eutanasia da dissanguamento via diretta puntura cardiaca. L&#39;eutanasia è confermato tramite pneumotorace bilaterale, dopo di che vengono raccolti i polmoni e lo snap-congelati per una successiva analisi.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Coincidente con il diffondersi di microscopia in vivo, vi è crescente apprezzamento sia per la notevole entità delle ESL così come i suoi numerosi contributi alla funzione vascolare. Questi dati emergenti, tuttavia, derivano principalmente da studi del sistema vascolare sistemica. In effetti, l&#39;uso di microscopia in vivo nel polmone è tecnicamente impegnativo, dato artefatto significativo movimento polmonare e cardiaca. Diversi recenti progressi tecnici hanno consen...

Il glicocalice endoteliale è uno strato extracellulare di proteoglicani e glicosaminoglicani associati costeggiano il vascolare intimale. In vivo, il glicocalice è altamente idratata, formando uno strato consistente superficie endoteliale (ESL) che regola una varietà di funzioni endoteliali compreso permeabilità di un fluido 1, neutrofili-endoteliale adesione 2, e l&#39;meccanotrasduzione di fluido 3 shear stress. Storicamente, il glicocalice è stata sottovalutata a causa della sua aberrance in preparazioni di cellule in coltura 4, 5 e la sua degradazione durante il fissaggio del tessuto standard e di elaborazione 6. L&#39;uso sempre più 7 di microscopia intravitale (microscopia in vivo, IVM) ha coinciso con elevato interesse scientifico per l&#39;importanza della ESL di funzione vascolare durante la salute e la malattia. L&#39;ESL è invisibile per microscopia ottica e non può essere facilmente etichettato invivo, data la propensione di fluorescenti glicocalice leganti lectine di provocare agglutinazione RBC 8 e fatale embolia polmonare (osservazioni non pubblicate). Diversi approcci indiretti sono quindi stati sviluppati per dedurre spessore ESL (e, per estensione, l&#39;integrità glicocalice) nei letti vascolari non-movimento, come l&#39;microcirculations cremastere e mesenterici. Queste tecniche comprendono la misurazione delle differenze in circolazione microparticella velocità in funzione della distanza dalla membrana endoteliale (immagine microparticella velocimetria 9) ​​così come la misurazione della esclusione di ingombranti, fluorescenza etichettati marcatori vascolari (ad esempio destrani) dalla superficie endoteliale (tecnica esclusione destrano 10, 11). Di queste tecniche, solo esclusione destrano è in grado di stimare spessore ESL da misurazioni effettuate in un singolo punto nel tempo. Da misurare simultaneamente larghezze vascolari mediante microscopia brightfield (larghezza inclusive del &quot;invisibile&quot; ESL) e microscopia a fluorescenza di un tracciante vascolare escluso dal ESL, spessore ESL può essere calcolato come metà della differenza tra due larghezze vascolari. L&#39;uso di una misura istantanea di spessore ESL è adatto per lo studio del glicocalice polmonare. Microscopia intravitale del polmone è impegnativo, dato significativo artefatti da movimento polmonare e cardiaca. Mentre recenti progressi permettono di immobilizzazione polmoni topo in vivo 12, 13, esistono preoccupazioni riguardo l&#39;impatto fisiologico di stasi polmonare. Immobilità polmonare è associato con una diminuzione di ossido nitrico endoteliale segnalazione 14, una via di segnalazione che ha un impatto sia l&#39;adesione dei neutrofili 15 e danno polmonare 16. Inoltre, immobilizzazione di una zona di polmone espone circostante alveoli mobili pregiudizievoli per forze di taglio (cosiddetti &quot;atelectrauma&quot;), secondo i concetti classici fisiologicheinterdipendenza alveolare 17. Nel 2008, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler e colleghi hanno sviluppato una tecnica chirurgica che consente per la microscopia intravitale di un polmone del mouse liberamente in movimento 18. Artefatto respiratorio derivanti da questa tecnica può essere negata con l&#39;uso di imaging ad alta velocità, compresa la misurazione simultanea di chiaro e microscopia a fluorescenza. In questo rapporto, dettaglio come istantanea di imaging esclusione destrano può essere impiegato per misurare lo spessore ESL nel microcircolo subpleurica di muoversi liberamente, in vivo polmone mouse. Questa tecnica può essere facilmente modificato per determinare glicocalice funzione-specifico, la capacità di un intatto ESL escludere circolanti elementi dalla superficie endoteliale. Abbiamo recentemente usato queste tecniche per determinare l&#39;importanza di integrità polmonare ESL allo sviluppo di danno polmonare acuto in malattie infiammatorie sistemiche come sepsi 2.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Nome del reagente </td></tr><tr><td> FITC-destrano (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> FD150S </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-destrano (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> T1287 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidina rivestite microsfere fluorescenti </td><td> Bangs Laboratories </td><td> CP01F/10428 </td><td> Drago Verde fluorescenza (simile a FITC) </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Moore Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xylazina </td><td> Moore Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-ICAM-1 biotinilato </td><td> eBioscience </td><td> Clone YN1/1.7.4 </td><td> Diluizione 1:50 </td></tr><tr><td> Isotipo anticorpo biotinilato </td><td> eBioscience </td><td> IgG2b eB149/10H5 </td><td> Diluizione 1:50 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ATTREZZATURE </td></tr><tr><td> Ventilatore meccanico </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Inspira </td><td></td></tr><tr><td> Tracheostomia catetere </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 730028 </td><td></td></tr><tr><td> Apparecchi Elettrocauterizzazione </td><td> DRE Medical </td><td> Valleylab SSE-2L </td><td></td></tr><tr><td> Cauterizzazione bipolare pinza </td><td> Olsen Medical </td><td> 10-1200i </td><td> 9,9 centimetri McPherson </td></tr><tr><td> Temperatura Control Sistema </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> ATC1000 </td><td></td></tr><tr><td> Pompa a siringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Pompa 11 Elite </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio (widefield) </td><td> Nikon </td><td> LV-150 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio (confocale) </td><td> Nikon </td><td> A1R </td><td></td></tr><tr><td> Image Splitter </td><td> Fotometrici </td><td> DV2 </td><td></td></tr><tr><td> Telecamera CCD </td><td> Fotometrici </td><td> CoolSNAP HQ2 </td><td></td></tr><tr><td> Immagine software di elaborazione </td><td> Nikon </td><td> NIS Elements </td><td></td></tr><tr><td> Membrana di polivinilidene </td><td> Kure Wrap </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fodera circolare </td><td> Bellco </td><td> 5CIR-1-BEL </td><td> 5 mm, uno spessore # </td></tr><tr><td> Colla (fodera a membrana) </td><td> Pattex </td><td> Flüssig (liquido) </td><td> Per l&#39;apposizione vetrino alla membrana </td></tr><tr><td> Colla (coperchio a scorrimento del mouse) </td><td> Pattex </td><td> Gel </td><td> Per il fissaggio della membrana per il mouse </td></tr><tr><td> Tubo chirurgico </td><td> Intramedic </td><td> PE50, PE10 </td><td></td></tr><tr><td> Suturare </td><td> Pescatore </td><td></td><td> Seta 04:00 </td></tr><tr><td> Rasoio elettrico </td><td> Oster </td><td> 78997 </td><td></td></tr><tr><td> Curve pinze chirurgiche </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dritti pinza chirurgica </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Forbici chirurgiche </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microforbici chirurgici </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ago chirurgico conducente </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nastro chirurgico </td><td> Pescatore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spugne da cucina (tagliati a spicchi) </td><td> vario </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo measurement of the mouse pulmonary endothelial surface layer

Il glicocalice endoteliale è uno strato di proteoglicani e glicosaminoglicani associati rivestono il lume vascolare. In vivo, il glicocalice è altamente idratata, formando uno strato consistente superficie endoteliale (ESL) che contribuisce al mantenimento della funzione endoteliale. Come il glicocalice endoteliale è spesso aberrante in vitro e si perde durante tecniche standard di fissazione dei tessuti, studio della ESL richiede l&#39;uso di microscopia intravitale. Per meglio approssimare la fisiologia complesso del microcircolo alveolare polmonare immagini intravitale è idealmente eseguita su un polmone liberamente mobile. Tali preparazioni, tuttavia, tipicamente soffrono di artefatti da movimento ampio. Si dimostra come chiuso petto microscopia intravitale di un polmone topo liberamente mobile può essere utilizzato per misurare l&#39;integrità glicocalice con esclusione ESL di fluorescenza destrani marcati ad alto peso molecolare dalla superficie endoteliale. Il mancato recupero tecnica chirurgica, che richiedebrightfield simultanea e imaging fluorescente del polmone mouse, consente l&#39;osservazione longitudinale del microcircolo subpleurica senza evidenza di indurre lesioni confondimento polmonare.

L&#39;approccio sperimentale descritto in fasi 1-6 consentirà cattura di fotogrammi di DIC simultanea (campo chiaro) e immagini fluorescenti. Per determinare lo spessore ESL, le immagini registrate vengono esaminati da un osservatore cieco dopo il completamento del protocollo sperimentale. Utilizzando un telaio a fuoco, subpleurica microvasi (&lt;20 micron di diametro) sono identificati; almeno 3 microvasi trovano tipicamente in un unico telaio (Figura 10). Utilizzando software di analisi di immagine (...

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In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

Il glicocalice endoteliale / endoteliale strato superficiale è perfettamente studiata usando la microscopia intravitale. Microscopia intravitale è tecnicamente difficile in un organo in movimento come il polmone. Si dimostra come brightfield simultanea e microscopia a fluorescenza possono essere utilizzate per stimare endoteliale spessore dello strato di superficie in un movimento liberamente<em&gt; In vivo</em&gt; Polmonare mouse.

Nella misura in vivo della superficie polmonare strato endoteliale mouse

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

14.5K Views.  University of Colorado School of Medicine. Il glicocalice endoteliale / endoteliale strato superficiale è perfettamente studiata usando la microscopia intravitale. Microscopia intravitale è tecnicamente difficile in un organo in movimento come il polmone. Si dimostra come brightfield simultanea e microscopia a fluorescenza possono essere utilizzate per stimare endoteliale spessore dello strato di superficie in un movimento liberamente In vivo Polmonare mouse.

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An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Test per la verifica della nave Permeabilità Sangue

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Ricerca

Medicina

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and repair damage in simple tissues in the orthopedic and periodontal fields. However, attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful because the biological processes of organ regeneration have not been well explored. It is becoming clear that angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays key roles in organ regeneration. Newly formed vasculatures not only deliver oxygen, nutrients and various cell components that are required for organ regeneration but also provide instructive signals to the regenerating local tissues. Therefore, to successfully regenerate lungs in an adult, it is necessary to recapitulate the lung-specific microenvironments in which angiogenesis drives regeneration of local lung tissues. Although conventional in vivo angiogenesis assays, such as subcutaneous implantation of extracellular matrix (ECM)-rich hydrogels (e.g., fibrin or collagen gels or Matrigel - ECM protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells), are extensively utilized to explore the general mechanisms of angiogenesis, lung-specific angiogenesis has not been well characterized because methods for orthotopic implantation of biomaterials in the lung have not been well established. The goal of this protocol is to introduce a unique method to implant fibrin gel on the lung surface of living adult mouse, allowing for the successful recapitulation of host lung-derived angiogenesis inside the gel. This approach enables researchers to explore the mechanisms by which the lung-specific microenvironment controls angiogenesis and alveolar regeneration in both normal and pathological conditions. Since implanted biomaterials release and supply physical and chemical signals to adjacent lung tissues, implantation of these biomaterials on diseased lung can potentially normalize the adjacent diseased tissues, enabling researchers to develop new therapeutic approaches for various types of lung diseases.

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

L&#39;impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Misurazione automatica di enfisema polmonare e piccole vie aeree ritocca in sigaretta Mice-fumo esposti

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Biologia

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

Isolamento delle cellule endoteliali polmonari primarie di topo

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Immunologia e infezioni

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

Misurazione dinamica e imaging di capillari, arterioli e periciti nel cuore del topo

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

Studio in vivo di Human Interaction endoteliale-pericyte Utilizzando la matrice di gel Plug Assay nel topo

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, respectively, hence playing a critical role in the homeostasis of the pulmonary system. Deregulation of SMC contractility contributes to several pulmonary diseases, including asthma and pulmonary hypertension. However, due to limited tissue access and a lack of culture systems to maintain in vivo SMC phenotypes, molecular mechanisms underlying the deregulated SMC contractility in these diseases remain fully identified. The precision-cut lung slice (PCLS) offers an ex vivo model that circumvents these technical difficulties. As a live, thin lung tissue section, the PCLS retains SMC in natural surroundings and allows in situ tracking of SMC contraction and intracellular Ca2+ signaling that regulates SMC contractility. Here, a detailed mouse PCLS preparation protocol is provided, which preserves intact airways and intrapulmonary arteries. This protocol involves two essential steps before subjecting the lung lobe to slicing: inflating the airway with low-melting-point agarose through the trachea and infilling pulmonary vessels with gelatin through the right ventricle. The PCLS prepared using this protocol can be used for bioassays to evaluate Ca2+-mediated contractile regulation of SMC in both the airway and the intrapulmonary arterial compartments. When applied to mouse models of respiratory diseases, this protocol enables the functional investigation of SMC, thereby providing insight into the underlying mechanism of SMC contractility deregulation in diseases.

The present protocol describes preparing and utilizing mouse precision-cut lung slices to assess the airway and intrapulmonary arterial smooth muscle contractility in a nearly in vivo milieu.

Utilizzo della fetta polmonare tagliata con precisione per studiare la regolazione contrattile delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the endothelial barrier dysfunction is related to many salivary gland secretory disorders. The present protocol describes an in vivo paracellular permeability detection method to evaluate the function of endothelial tight junctions (TJs) in mouse submandibular glands (SMG). First, fluorescence-labeled dextrans with different molecular weights (4 kDa, 40 kDa, or 70 kDa) were injected into the angular veins of mice. Afterward, the unilateral SMG was dissected and fixed in the customized holder under a two-photon laser-scanning microscope, and then images were captured for blood vessels, acini, and ducts. Utilizing this method, the real-time dynamic leakage of the different-sized tracers from blood vessels into the basal sides of the acini and even across the acinar epithelia into the ducts was monitored to evaluate the alteration of the endothelial barrier function under physiological or pathophysiological conditions.

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In the present protocol, the endothelial barrier function of the submandibular gland (SMG) was evaluated by injecting different molecular weighted fluorescent tracers into the angular veins of test animal models in vivo under a two-photon laser-scanning microscope.

In vivo Rilevamento della permeabilità vascolare nella ghiandola sottomandibolare del topo

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

Nella misura in vivo della superficie polmonare strato endoteliale mouse

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L'impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica