Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal NIH concedere K99EB009096-01A1 a JM-M.

1. Preparazione <ol><li> Fai EGM-2 di media (500 ml) <ul><li> Aggiungere 100 ml di siero fetale bovino (FBS) a 395 mL di endoteliale medio basale (EBM-2). </li><li> Aggiungere 5 ml di 100x Glutamina-penicillina-streptomicina soluzione (GPS). </li><li> Aggiungere tutti gli EGM-2 supplementi SingleQuots ad eccezione di idrocortisone (cioè, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, eparina, acido ascorbico, e GA-1000). </li><li> Filtro sterilizzato con un 0,2 micron filtro vuoto dimensioni dei pori. </li></ul></li><li> Fai la media MSCGM (500 ml) <ul><li> Aggiungere 5 ml di GPS 100x a 440 ml di mesenchimali medio basale delle cellule staminali (MSCBM). </li><li> Aggiungere tutto il contenuto del kit MSCGM SingleQuots. </li><li> Aggiungi hFGF-B aliquota da EGM-2 supplementi SingleQuots. </li><li> Filtro sterilizzato con un 0,2 micron filtro vuoto dimensioni dei pori. </li></ul></li><li> Fai DMEM media (500 ml) <ul><li> Aggiungere 50 ml di siero fetale bovino (FBS) a 440 ml di glucosio 1x alta Dulbecco modificato (DMEM). </li><li> Aggiungere 5 ml di GPS 100x. </li><li> Aggiungere 5 ml di soluzione di aminoacidi non essenziali. </li><li> Filtro sterilizzato con un 0,2 micron filtro vuoto dimensioni dei pori. </li></ul></li><li> Fai collagene / fibronectina soluzione (3,6 ml; fatta lo stesso giorno di iniezione) <ul><li> Aggiungere 0,4 ml di DMEM 10x a 150 ml di distillato H 2 O. </li><li> Aggiungere 100 ml di HEPES 1M (25 mM finale). </li><li> Accuratamente, aggiungere 2,4 ml di collagene bovino (5 mg / ml magazzino; 3 mg / ml finale) e mescolare delicatamente sul ghiaccio. </li><li> Regolare il pH neutro con l&#39;aggiunta di 1N NaOH (circa 30 mL). </li><li> Usa indicatore rosso fenolo per valutare pH neutro; alternativa, utilizzare la carta di prova per il monitoraggio del pH pH. </li><li> Aggiungere 120 ml di fibronectina umana (1 mg / ml di brodo, 30 mg / ml finale) </li><li> Aggiungere 0,4 ml di FBS (10% finale) </li><li> mantenere soluzione in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li></ul></li><li> Preparare la soluzione di fibrinogeno (1 ml; fatta lo stesso giorno di iniezione) <ul><li> Aggiungere 30 mg di fibrinogeno in polvere per 1 ml di NaCl 0.9N (pH 7,4) soluzione (30 mg / ml finale). </li><li> Prima dell&#39;uso, incubare la soluzione fibrinogeno a 37 ° C per 30 minuti. </li><li> Mescolare delicatamente, senza vortex, prima della sua Oltre al collagene / fibronectina gel. </li></ul></li><li> Preparare la soluzione di trombina (200 ml) <ul><li> Aggiungere 1 KU della trombina in polvere a 200 ml di soluzione salina allo 0.9% NaCl normale (50 U / mL). </li><li> Filtro sterilizzato con un 0,2 micron filtro pori siringa dimensioni e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Prima dell&#39;uso, diluire con soluzione fisiologica 0,9% NaCl normale ad una concentrazione finale di 10 U / mL. </li></ul></li><li> Fare 1% di soluzione di gelatina (500 ml) <ul><li> Aggiungere 5 g di gelatina in polvere per 500 ml di fosfato di soluzione salina tamponata Dulbecco (PBS). </li><li> Sterilizzati in autoclave a 121 ° C per 30 min. </li><li> Filtro sterilizzato con un 0,2 micron filtro vuoto dimensioni dei pori. </li></ul></li><li> Cappotto da 100 mm piastre di coltura di tessuto con 1% di soluzione di rivestimento di gelatina <ul><li> Aggiungere 10 ml di soluzione all&#39;1% di gelatina per ogni 100 mm piastra di coltura. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C per 60 min. </li><li> Prima dell&#39;uso, rimuovere la soluzione di gelatina e lavare i piatti una volta con PBS. </li></ul></li></ol> 2. Cultura del cordone ombelicale umano derivati ​​dal sangue umano endoteliali che formano colonie Cells (ECFCs) Questo protocollo si assume fiale congelate ECFC sono disponibili nel laboratorio prima di questo esperimento. ECFC può essere isolata dalla frazione di cellule mononucleate del sangue sia del cordone ombelicale o adulte del sangue periferico come descritto in precedenza 7. <ol><li> Scongelare un flaconcino di ECFCs (tipicamente 0.5-1x10 6 cellule in 1 ml di mezzi di congelamento) prelevata dal serbatoio di stoccaggio di azoto liquido e subito diluirne il contenuto in un tubo da 15 ml conica contenente 10 ml di terreno DMEM. Rotazione a 1200 rpm per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di caldo EGM-2 di media. </li><li> Aggiungere i 10 ml di sospensione ECFC in un 1% di gelatina rivestite da 100 mm piastra di coltura dei tessuti. Porre la piastra in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2. Il giorno dopo, aspirato delicatamente le cellule non legato e medie imprese, e dei mangimi legati cellule con 10 ml di fresca EGM-2 di media. </li><li> Alimentare la piastra ogni 2-3 giorni con EGM-2 di media. Consentono alle cellule di espandere in modo che la piastra è coperta da un monostrato confluenti cellulare. Alla confluenza, le cellule sottocultura come segue: </li><li> Aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con 10 ml di PBS. </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA soluzione per ogni 100 mm piatto. Agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente la tripsina-EDTA soluzione. Incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 3-5 minuti. Battere delicatamente la piastra per vedere le cellule in sospensione staccato sotto un microscopio invertito. </li><li> Quando le cellule staccare completamente, aggiungere 8 mL di EGM-2 medie e raccogliere la soluzione delle cellulezione in un tubo da 15 ml conica. Prendere 10 L per contare le cellule in una emocitometro ed elaborare il numero totale delle cellule raccolte. </li><li> Piastra le cellule in piastre di tessuto 1% di gelatina rivestita di coltura ad una densità di semina di 5.000 cellule / cm 2 utilizzando EGM-2 di media. Posizionare le piastre in incubatrice e dar loro da mangiare ogni 2-3 giorni con EGM-2 di media. </li></ol> Ripetere questa procedura per i passaggi successivi. Tenere traccia del numero di passaggio come la popolazione di cellule è espanso. ECFCs saranno utilizzati tra passaggi 4-8. 3. Cultura di ossa umane derivate dal midollo cellule staminali mesenchimali (MSCs) Questo protocollo si assume fiale congelati di MSC umane sono disponibili nel laboratorio prima di questo esperimento. MSC possono essere isolate dal midollo osseo aspirati come descritto in precedenza 11. <ol><li> Scongelare un flaconcino di cellule staminali mesenchimali (tipicamente 0.50-1x10 6 cellule in 1 ml di mezzi di congelamento) prelevata dal serbatoio di stoccaggio di azoto liquido e subito diluirne il contenuto in un tubo da 15 ml conica contenente 10 ml di terreno DMEM. Rotazione a 1200 rpm per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di medium MSCGM caldo. </li><li> Aggiungere i 10 ml di sospensione MSC in una patinata da 100 mm piastra di coltura. Porre la piastra in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2. Il giorno dopo, aspirato delicatamente le cellule non legato e medie imprese, e dei mangimi legati cellule con 10 ml di medium MSCGM fresca. </li><li> Alimentare la piastra ogni 2-3 giorni con media MSCGM. Consentono alle cellule di espandere in modo che la piastra raggiunge l&#39;80% dei confluenti monostrato cellulare. Al 80% confluenza, le cellule sottocultura come segue: </li><li> Aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con 10 ml di PBS. </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA soluzione per ogni 100 mm piatto. Agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente la tripsina-EDTA soluzione. Incubare a 37 ° C e 5% di CO2 per 3-5 minuti. Battere delicatamente la piastra per vedere le cellule in sospensione staccato sotto un microscopio invertito. </li><li> Quando le cellule staccare completamente, aggiungere 8 ml di terreno MSCGM e raccogliere la soluzione in una cella da 15 ml tubo conico. Prendere 10 L per contare le cellule in una emocitometro ed elaborare il numero totale delle cellule raccolte. </li><li> Piastra le cellule dei tessuti non rivestiti in lastre di coltura ad una densità di semina di 10.000 cellule / cm 2 utilizzando medium MSCGM. Posizionare le piastre in incubatrice e dar loro da mangiare ogni 2-3 giorni con media MSCGM. </li></ol> Ripetere questa procedura per i passaggi successivi. Tenere traccia del numero di passaggio come la popolazione di cellule è espanso. MSC saranno utilizzati tra passaggi 4-8. 4. Risospensione delle celle di collagene / fibronectina / Fibrinogen Solution (giorno 0) Prima dell&#39;esperimento, assicurarsi che non vi sono abbastanza ECFCs e MSC nella cultura; 6 ECFCs 0.8x10 e 1.2x10 MSC 6 sarà richiesto per ogni impianto e mouse. <ol><li> Aspirare il mezzo di ogni piastra di coltura e lavare le cellule con 10 ml di PBS. Rimuovere PBS e aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA soluzione per ogni 100 mm piatto. Agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente la tripsina-EDTA soluzione. Incubare per 3-5 minuti. Battere delicatamente la piastra per vedere le cellule in sospensione staccato sotto un microscopio invertito. </li><li> Quando le cellule staccare completamente, aggiungere 8 ml di terreno DMEM e raccogliere la soluzione in una cella da 15 ml tubo conico. Prendere 10 L per contare le cellule in una emocitometro ed elaborare il numero totale di ECFCs e MSC raccolto. </li><li> Trasferimento 4x10 6 ECFCs (5x 0.8x10 6 celle) e 6x10 6 PPM (5x 1.2x10 6 celle) insieme in un unico tubo da 50 ml conica. Questa è la quantità totale di cellule necessario per cinque impianti singoli e topi. Centrifugare a 1200 rpm e rimuovere il surnatante. </li><li> Delicatamente, aggiungere 100 uL di soluzione Fibrinogen a 0,9 ml di collagene / fibronectina soluzione (3 mg / ml concentrazione di fibrinogeno finale); mantenere la miscela in ghiaccio. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di ghiaccio freddo collagene / fibronectina / fibrinogeno soluzione; mescolare le cellule molto delicatamente per evitare bolle. Caricare il composto in una 1-ml siringa sterile, e piazzare una 26-gauge con il suo cappello sulla punta della siringa. Tenere la siringa caricata sul ghiaccio fino ad iniezione. </li></ol> 5. L&#39;iniezione in mouse immunodeficienti Nude (giorno 0) Tutti gli esperimenti sugli animali saranno effettuate con 6 settimane di età atimici nudi (nu / nu) topi. <ol><li> Prima della iniezione, anestetizzare i topi immunodeficienti mettendoli in una camera a gas offrendo isoflurano. Lasciare i topi di inalare il isoflurano per circa 2 minuti fino a quando sono anestetizzati e non risponde a pizzico tep (monitorare il loro cuore batte per l&#39;ispezione). </li><li> Per ogni mouse, iniettare 50 ml di soluzione di trombina (10 U / mL) per via sottocutanea nella regione dorsale superiore utilizzando una 26-gauge. </li><li&gt; Nello stesso luogo dove è stato iniettato trombina, iniettare 200 ul della miscela di cellule utilizzando un 26-gauge. Collagene gel a 37 ° C e fibrinogeno gel di fibrina si forma in presenza di trombina. Di conseguenza, l&#39;impianto dovrebbe formare un piccolo, ma apprezzabile, bump sotto la pelle. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, posizionare il mouse su uno strato di garza per il comfort e calore e osservarle fino a diventare ambulatoriale. Poi, dopo, osservare i topi giorno per i primi tre giorni. </li></ol> 6. La raccolta (Giorno 7) <ol><li> Una settimana dopo le iniezioni, eutanasia i topi mettendoli in una camera a gas compresso fornire gas CO 2. </li><li> Una volta eutanasia, aprì la pelle vicino alla zona di iniezione e rimuovere chirurgicamente la spina gel. Fotografie digitali dei tappi gel recuperato con una scala si consiglia. </li><li> Posizionare i tappi di gel raccolte in cassette istologiche e profondo li in 10% formalina tamponata neutra durante la notte a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la fissazione, lavare il 10% di formalina tamponata neutra via con acqua distillata H 2 O e posto le cassette istologiche a 4 ° C in PBS fino valutazione istologica. </li></ol> 7. Valutazione: Istologia (H &amp; E) e immunoistochimica (hCD31) <ol><li> Per la valutazione istologica, gli impianti sono inclusi in paraffina e sezionati (7 micron di spessore sezioni) utilizzando le normali procedure istologiche. </li><li> Quantificare la densità dei microvasi dalla valutazione di Hematoxilin e eosina (H &amp; E) sezioni colorate tratto da la parte centrale degli impianti. Protocolli standard per la colorazione H &amp; E può essere trovato altrove. Microvasi possono essere identificati come strutture luminale contenenti globuli rossi. Segnala densità microvasi come il numero medio di sangue di globuli rossi pieni di microvasi dai campi analizzati e espressa come navi / mm 2. </li><li> Per dimostrare la natura umana dei vasi microvascolare, le sezioni della protesi devono essere recuperate immunoistochimiche colorate con un essere umano specifico per CD31 (hCD31) anticorpi utilizzando protocolli standard di colorazione. Si consiglia di utilizzare il topo monoclonale anti-CD31 umano da anticorpi DakoCytomation (Clone JC70A;. Cat # M0823) ad una diluizione 1:100. La specificità umana di questo anticorpo è stata confermata dalla reazione negativa ottenuta con una varietà di sezioni di tessuto mouse che sono stati colorati in parallelo 7,11. Di nota, i vasi sanguigni del mouse si vedono spesso all&#39;interno degli impianti (in particolare intorno al confine), ma vasi del mouse non si macchia positiva con questo anticorpo. Inoltre, la presenza di MSC umane possono essere rilevati attraverso prova immunoistochimica con anticorpi specifici anti-umano contro CD90 o α-actina del muscolo liscio (α-SMA). MSC umane si trovano sia nella regione perivascolare di recente formazione dei vasi sanguigni e interstizialmente situati in tutto l&#39;impianto 11. </li></ol> 8. Rappresentante Risultati <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig1.jpg" /> Figura 1. Aspetto tipico di ECFC e culture MSC. Microscopio contrasto di fase visualizzare il tipico aspetto del ECFCs e MSC in coltura. (A) monostrato confluenti di sangue del cordone derivati ​​ECFCs visualizzare la caratteristica acciottolata, morfologia delle cellule endoteliali. (B) L&#39;osso umano cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo visualizzazione di una morfologia forma mandrino. Scaler bar, 200 um. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig2.jpg" /> Figura 2. Aspetto di spine espiantati al giorno 7. Derivati ​​dal sangue umano ECFCs midollo osseo e cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo sono stati incorporati in collagene / fibronectina / gel di fibrina e impiantato sottocute in topi nudi, come descritto nel testo. (A) Dopo 7 giorni, una volta che il mouse è stato l&#39;eutanasia, aprì la pelle vicino alla zona di iniezione ed esporre la cellula / gel spina girando la pelle. (B) Aspetto della spina rimossi chirurgicamente dal mouse e prima della fissazione in formalina. Il colore rosso della protesi è indice di vascolarizzazione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig3.jpg" /> Figura 3. Identificazione istologica di rete vascolare in spine espiantati. Hematoxilin e eosina (H &amp; E) sezioni colorate tratto dalla parte centrale dei tappi espiantati. (A) a basso ingrandimento (10x) Micrografia visualizzare l&#39;impianto (segnato da una linea gialla tratteggiata) nel contesto di tessuti dell&#39;ospite circostanti (ad esempio, il tessuto adiposo e muscolo scheletrico). (B) Alto ingrandimento (40x) Micrografia visualizzazione microvasi multipli (freccia gialla che punta ad alcuni di loro) all&#39;interno del tappo; microvasi possono essere identificati come strutture luminale contenenti globuli rossi. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig4.jpg" /> Figura 4. Identificazione immunoistochimica di umanolumen. immunoistochimiche sezioni colorate tratto dalla parte centrale dei tappi espiantati. La colorazione è stata effettuata utilizzando un mouse anticorpo monoclonale anti-CD31 umano (hCD31) da anticorpi DakoCytomation (Clone JC70A;. Cat # M0823) ad una diluizione 1:100; nuclei cellulari erano di contrasto con hematoxilin. (A) a basso ingrandimento (10x) Micrografia visualizzare l&#39;impianto (delineato da una linea nera tratteggiata) nel contesto di tessuti circostanti ospitante. Umano specifico, CD31-positive microvasi sono macchiati di marrone (colorazione con perossidasi). (B) Alta ingrandimento (40x) Micrografia la visualizzazione di più umano microvasi (nero punta di freccia che punta ad un certo hCD31-positivi lumen) all&#39;interno della spina.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Si tratta di un modello sperimentale di bioingegneria reti umane vascolare. Le caratteristiche principali di questo modello sono: 1) microvasi sono formate da cellule umane isolate da post-natale dei tessuti (ad esempio, sangue e midollo osseo), 2) si formano microvasi in un animale adulto e 3) microvasi non nascono dalla pre -esistenti (host) le navi, ma invece si formano, de novo, dalle singole cellule sospese in un gel adatto. Angiogenesi svolge un ruolo importante in questo saggio, perché le connessioni al sistema vascolare murino sono necessari per ottenere cellule piene di rosso vasi sanguigni, uno dei più funzionali di read-out in questo saggio. Inoltre, le cellule mieloidi host vengono reclutati per l&#39;impianto nei primi anni post-trapianto giorni, e sono necessari per la formazione del nuovo letto vascolare 12. Questo modello sperimentale offre un versatile sistema modello quantificabili, e relativamente semplice per lo studio post-natale formazione di reti vascolari umane in vivo. Inoltre, questo test è semplice da eseguire e non richiede un&#39;incisione o una procedura chirurgica. Il modello potrebbe essere utilizzato per studiare il potenziale vascolare di diverse fonti di cellule endoteliali umane e perivascolare. Il modello potrebbe essere usato per individuare anti-e / o pro-vascolare composti. Infine, il modello può essere utilizzato per studiare il ruolo di (s) di specifici geni nella formazione e la funzione di una rete composta da endotelio vascolare umano.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Endoteliali medio basale, EBM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2 SingleQuot integratori </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamina-penicillina-streptomicina soluzione, 100x GPS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 30-009-CI </td><td></td></tr><tr><td> Cellule staminali mesenchimali BulletKit crescita Medio, MSCBM / MSCGM </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td></td></tr><tr><td> Alta glucosio Dulbecco Modified Aquila Medio, 1x DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> MEM non essenziali soluzione di aminoacidi, 100x NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Alta glucosio Dulbecco Modified Eagle, in polvere DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES Soluzione tampone </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex bovina soluzione collagene I </td><td> Trevigen </td><td> 3442-050-01 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex umani fibronectina </td><td> Trevigen </td><td> 3420-001-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fibrinogeno nel plasma di bovini </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F8630-1G </td><td></td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Pescatore </td><td> DF0143-17-9 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di soluzione salina tamponata Dulbecco, PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA soluzione, 1x </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano, liquido per inalazione </td><td> Buxter Healthcare Corporation </td><td> NDC 10019-360-40 </td><td></td></tr><tr><td> Trombina bovina da plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T4648-1KU </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di formalina, Neutro Buffered </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Monoclonali Mouse Anti-Human CD31 anticorpi </td><td> DakoCytomation </td><td> M0823 </td><td> Clone JC70A </td></tr></tbody></table>

bioengineering human microvascular networks in immunodeficient mice

Il futuro di ingegneria dei tessuti e terapie basate sulle cellule per la rigenerazione dei tessuti probabilmente fare affidamento sulla nostra capacità di generare reti funzionali vascolare in vivo. A questo proposito, la ricerca di modelli sperimentali di costruire reti di vasi sanguigni in vivo è della massima importanza 1. La fattibilità di reti di bioingegneria microvascolare in vivo è stato dimostrato utilizzando tessuti umani di derivazione cellule mature endoteliali (EC) 2-4, tuttavia, come le cellule endoteliali autologhe problemi presenti per un uso a livello clinico, perché sono difficili da ottenere in quantità sufficienti e richiedono raccolta da vasi esistenti. Queste limitazioni hanno istigato la ricerca di altre fonti di ECS. L&#39;identificazione delle colonie endoteliali che formano le cellule (ECFCs) nel sangue ha presentato l&#39;opportunità di ottenere in modo non invasivo EC 5-7. Noi e altri autori hanno dimostrato che ECFCs derivati ​​dal sangue umano adulto e del midollo hanno la capacità di forma funzionale delle reti vascolari in vivo 7-11. È importante sottolineare che questi studi hanno anche dimostrato che per ottenere le reti vascolari stabile e duratura, ECFCs richiedono co-impianto con le cellule perivascolari. Il test che descriviamo qui illustra questo concetto: si mostra come il sangue del cordone umano di derivazione ECFCs può essere combinato con derivate dal midollo osseo le cellule staminali mesenchimali (MSCs), come una sospensione singola cella di un collagene / fibronectina / fibrinogeno gel per formare un essere umano funzionale rete vascolare entro 7 giorni dopo l&#39;impianto in un mouse immunodeficienti. La presenza di risorse umane ECFC alberato lumen contenente eritrociti host può essere visto in tutta la protesi che indicano non solo la formazione (de novo) di una rete vascolare, ma anche lo sviluppo di anastomosi funzionale con il sistema circolatorio host. Questo modello murino di bioingegneria rete vascolare umano è l&#39;ideale per gli studi sui meccanismi cellulari e molecolari della formazione della rete vascolare umano e per lo sviluppo di strategie per vascolarizzano tessuti ingegnerizzati.

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Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

Qui, descriviamo una metodologia per fornire cordone umano derivati ​​dal sangue umano endoteliali che formano colonie cellule (ECFCs) e dal midollo osseo le cellule staminali mesenchimali (MSCs), inserita in un collagene / fibronectina gel, per via sottocutanea in topi immunodeficienti. Questa cella / gel combinazione genera una rete umana vascolare che collega con la vascolarizzazione del mouse.

Bioingegneria reti umane in topi immunodeficienti microvascolari

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  Harvard Medical School. Qui, descriviamo una metodologia per fornire cordone umano derivati ​​dal sangue umano endoteliali che formano colonie cellule (ECFCs) e dal midollo osseo le cellule staminali mesenchimali (MSCs), inserita in un collagene / fibronectina gel, per via sottocutanea in topi immunodeficienti. Questa cella / gel combinazione genera una rete umana vascolare che collega con la vascolarizzazione del mouse.

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Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utilizzando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) per sviluppare strumenti diagnostici

Ricerca

Biologia

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-linfociti Capture utilizzando un chip monouso Microfluidic per l&#39;HIV

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titolo Incapsulamento cella di goccioline

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Incapsulamento cellulare in idrogel 3D per l&#39;ingegneria tissutale

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Visualizzazione delle cellule interstiziali di Cajal (ICC) di rete in topi

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are pluripotent, thus having the potential to differentiate into multiple lineages. Such properties make ESCs extremely attractive for cell based therapy and regenerative treatment applications 1. However for its full potential to be realized the cells have to be differentiated into mature and functional phenotypes, which is a daunting task. A promising approach in inducing cellular differentiation is to closely mimic the path of organogenesis in the in vitro setting. Pancreatic development is known to occur in specific stages 2, starting with endoderm, which can develop into several organs, including liver and pancreas. Endoderm induction can be achieved by modulation of the nodal pathway through addition of Activin A 3 in combination with several growth factors 4-7. Definitive endoderm cells then undergo pancreatic commitment by inhibition of sonic hedgehog inhibition, which can be achieved in vitro by addition of cyclopamine 8. Pancreatic maturation is mediated by several parallel events including inhibition of notch signaling; aggregation of pancreatic progenitors into 3-dimentional clusters; induction of vascularization; to name a few. By far the most successful in vitro maturation of ESC derived pancreatic progenitor cells have been achieved through inhibition of notch signaling by DAPT supplementation 9. Although successful, this results in low yield of the mature phenotype with reduced functionality. A less studied area is the effect of endothelial cell signaling in pancreatic maturation, which is increasingly being appreciated as an important contributing factor in in-vivo pancreatic islet maturation 10,11.
The current study explores such effect of endothelial cell signaling in maturation of human ESC derived pancreatic progenitor cells into insulin producing islet-like cells. We report a multi-stage directed differentiation protocol where the human ESCs are first induced towards endoderm by Activin A along with inhibition of PI3K pathway. Pancreatic specification of endoderm cells is achieved by inhibition of sonic hedgehog signaling by Cyclopamine along with retinoid induction by addition of Retinoic Acid. The final stage of maturation is induced by endothelial cell signaling achieved by a co-culture configuration. While several endothelial cells have been tested in the co-culture, herein we present our data with rat heart microvascular endothelial Cells (RHMVEC), primarily for the ease of analysis.

The current study describes a directed differentiation approach in inducing pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Of great significance is the finding that endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell derived pancreatic progenitors into insulin expressing cells.

Delle cellule endoteliali Co-cultura Maturazione media di Cellule Staminali embrionali umane a cellule pancreas che producono insulina in un approccio di differenziazione Regia

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seq Analisi trascrittomi in trombina-trattati e di controllo dell&#39;uomo polmonari cellule endoteliali microvascolari

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in mammals. However, humans cannot oxidize cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid to cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid due to a primary exon deletion of the CMAH gene. To understand the effects and implications of the lack of CMAH activity in more detail, a Cmah knock-out model in mice is of keen interest in basic and applied research. The analysis method to determine the phenotype of this mouse model is herein described in detail, and is based on the detection of both N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in the liver and milk of wild-type and Cmah knock-out mice. Endogenous sialic acids are released and derivatized with o-phenylenediamine to generate fluorogenic derivatives, which can be subsequently analyzed by HPLC. The presented protocol can be also applied for the analysis of milk and tissue samples from various other origins, and may be of use to investigate the nutritional and health effects of N-glycolylneuraminic acid.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

We describe a HPLC-based method for the determination of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in mouse liver and milk.

Determinazione degli acidi sialici nei campioni di fegato e latte di tipo selvatico e<em&gt; CMAH</em&gt; Mouse Knock-out.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

Flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano