The authors have no Acknowledgements.

1. Preparazione delle cellule <ol><li> cellule in crescita <ol><li> Grow D. cellule discoideum a medio AX a 23 ° C sotto la luce nelle piastre di coltura di tessuti. Evitare di tenere le cellule ad alta densità superiore al 75% di confluenza. NOTA: Per una risposta ottimale al calore stress, le cellule devono essere in fase di crescita esponenziale e non abbiano raggiunto fase stazionaria. </li><li> Il giorno prima di imaging, le cellule diviso in media di fluorescenza bassa (LFM) a 1 x 10 4 cellule / ml. NOTA: Questo passaggio è necessario per ridurre la fluorescenza di fondo causato dal fluido AX. Il tempo di incubazione può essere ridotto ad un minimo di 2 ore. Tuttavia, vescicole prese in media AX possono ancora generare qualche segnale di fondo dopo 2 ore. </li></ol></li><li> Cellule Preparazione per la microscopia <ol><li> Prima di imaging, le cellule raccolta dalla piastra di tessuto in LFM e trasferire un numero adeguato di cellule in piatti di fondo di vetro. NOTA: Solitamente,1 x 10 5 cellule / ml è sufficiente; tuttavia, se il setup sperimentale richiede periodi lunghi di imaging (più di 8 ore), il numero di cellule devono essere adeguati con attenzione, come D. cellule discoideum passeranno al ciclo di sviluppo e iniziare a trasmettere e globale se il numero di cellule sono elevati, mentre le sostanze nutrienti sono bassi. </li><li> Permettono alle cellule di stabilirsi per 20 min. Rimuovere le cellule non regolati sostituendo con attenzione il mezzo utilizzato con terreno fresco. </li></ol></li></ol> 2. Imaging NOTA: Il protocollo può essere utilizzato su sistemi a grande campo così come in configurazioni microscopia confocale. L&#39;utilizzo di una scatola di incubazione a temperatura controllata che copre gli obiettivi e la fase microscopio è utile, ma non essenziale per il controllo della temperatura. La temperatura della scatola incubazione è impostata la temperatura più alta usata nell&#39;esperimento, ad esempio, a 40 ° C se viene eseguita stress termico. Altrimenti, la temperatura viene impostata su 256; C. I cambiamenti di temperatura devono essere fatte in anticipo per consentire al sistema di adattarsi, come variazioni di temperatura durante l&#39;imaging possono influenzare la messa a fuoco. NOTA: Durante l&#39;imaging, la temperatura viene controllata utilizzando una camera di raffreddamento. La temperatura di default per l&#39;imaging cellule non-ha sottolineato è 23 ° C. Per le condizioni di tensione termica, la temperatura viene aumentata di conseguenza al livello desiderato. L&#39;elemento piezoelettrico nella camera di raffreddamento può rispondere molto rapidamente al cambiamento di temperatura. Tuttavia, il focus delle immagini può variare leggermente (può discostarsi fino a 20 micron a seconda del cambiamento di temperatura). Così rifocalizzazione manualmente all&#39;interno i primi minuti di acquisizione dell&#39;immagine, a meno che il microscopio utilizzato è dotato di un hardware di autofocus. <ol><li> L&#39;acquisizione delle immagini in condizioni di non-stress <ol><li> celle di immagine in condizioni di non-ha sottolineato a 23 ° C, acquistano un minimo di 6 campi di vista (FOV). NOTA: condizione non lo stress può essere visualizEd entrambi registrando un breve time-lapse (5-30 min) o l&#39;acquisizione di immagini fisse rappresentative. Per ogni linea di condizione o di cellule acquisire un minimo di 6 campi di vista (FOV). NOTA: Nel caso le singole celle sono di interesse, posizionare le rispettive cellule nel mezzo del FOV e registrare una serie di piastrelle 3 x 3 con il FOV contenente le cellule di interesse nel mezzo D.. cellule discoideum sono mobili e possono migrare fuori del campo di vista. Tuttavia, la serie di piastrelle 3 x 3 aumenta l&#39;area potenzialmente esplorato dalla cella di interesse e rimane tracciabile per periodi time-lapse di ~ 6 ore. </li><li> Acquisire z-pile di massimo 7 micron di 1-0.25 micron passi per catturare l&#39;intero volume della cella. </li><li> Acquisire un&#39;immagine di campo chiaro riferimento per valutare il numero totale di cellule. </li></ol></li><li> Acquisizione di immagini per lo stress termico <ol><li> Regolare la temperatura della camera di raffreddamento a 30 ° C secondo le istruzioni del produttore. &lt;/ Li&gt; <li> Dopo che il display della temperatura ha raggiunto il valore desiderato, riorientare manualmente il canale in campo chiaro e visualizzate tutte FOV registrati prima di iniziare il time-lapse. </li><li> Avviare un time-lapse per 4 ore di stress da calore, con un intervallo di tempo di 5-10 minuti tra i punti di tempo. Controllare la corretta messa a fuoco durante l&#39;acquisizione dei primi due punti di tempo. </li></ol></li><li> Acquisizione di immagini durante il recupero <ol><li> Dopo lo stress da calore, ridurre la temperatura torna a 23 ° C, attendere che il display della temperatura per regolare e riorientare manualmente. </li><li> Registra filmati time-lapse in fase di recupero per 8-10 ore a 10-20 intervalli di tempo min. Controllare la corretta messa a fuoco durante l&#39;acquisizione del primo punto temporale. </li></ol></li></ol> Analisi 3. Immagine NOTA: per quantificare il numero di cellule che ospitano foci citosolica, valuta il numero totale di cellule e il numero di cellule con foci citosolico in ogni tempotelaio. A causa della difficoltà di segmentare cellule da immagini in campo chiaro, la quantificazione deve essere fatto manualmente. Qui di seguito, l&#39;analisi dei dati è descritto per il pacchetto gratuito di elaborazione delle immagini ((http://fiji.sc/Fiji). Si richiede il plugin &quot;Cell Counter&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol><li> Valutare il numero totale di cellule <ol><li> Caricare l&#39;immagine in campo chiaro stack (XYT) facendo clic su &quot;File&quot; e &quot;Apri&quot;. </li><li> Aprire il plugin &quot;Cell Counter&quot; ( &quot;Plugins&quot; - &quot;Cell Counter&quot;). Caricare la risma immagine cliccando su &quot;Inizializza&quot;. </li><li> Scegliere il tipo appropriato di contatori barrando l&#39;apposita casella. NOTA: l&#39;uso di tipo 1 come contatore per il numero totale di cellule e di tipo 2 come contatore per le cellule con focolai citosolico. Contare tutte le cellule. </li><li> Salvare i marcatori cliccando &quot;Save Markers&quot;. </li></ol></li><li> Valutare il numero di cellule con focolai citosolica <ol> &lt;li&gt; Caricare il HyperStack immagine di fluorescenza (XZYT) ( &quot;File&quot; - &quot;Apri&quot;) e fare una proiezione massima intensità utilizzando la &quot;Z-proiettore&quot; (Immagine / pile). </li><li> Aprire il plugin &quot;Cell Counter&quot;. Caricare l&#39;immagine risultante pila (XYT) facendo clic su &quot;Inizializza&quot;. </li><li> Caricare i marcatori facendo clic su &quot;Carica&quot; ​​Markers. ATTENZIONE: I nomi dei file di immagine di riferimento e lo stack di fluorescenza devono essere identici. Se necessario, rinominare di conseguenza prima di inizializzare lo stack di immagini. </li><li> Scegliere il tipo di indicatore appropriato (vedi 3.1.3) e contare le cellule con focolai citosolico. I marcatori esistenti possono essere utilizzati come guida per la posizione delle singole cellule. </li><li> Recuperare il numero di conteggi per fetta cliccando su &quot;Risultati&quot; e salvare i conteggi altrove per ulteriori calcoli. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il protocollo qui descritto può essere usato per studiare il comportamento di una particolare proteina di interesse in risposta allo stress indotto da calore. Aumento della temperatura a 30 ° C è stato segnalato per innescare la risposta allo stress termico e in queste condizioni la vitalità di D. discoideum è marcatamente ridotta. modifiche Il protocollo può essere modificato per confrontare il comportamento delle varie proteine ​​nelle stesse condizioni di stress. Per questo, le cellule che esprimono proteine ​​diverse con lo stesso tag fluorescenti vengono trasferiti in piatti multi-e, come quattro piatti da camera (sezione 1.3.1). Il protocollo può essere applicato anche su cellule co-esprimono proteine ​​con differenti marcatori, come GFP o RFP. Questo può essere ad esempio utilizzato per monitorare il comportamento delle varie componenti del sistema di controllo qualità delle proteine ​​(PQC). Le cellule che esprimono marcatore aggregazione GFP-tagged e diversi componenti PCQ RFP-tag possono essere osservate con multi-pozzobombati per l&#39;imaging. Questo garantisce le stesse condizioni di stress (velocità di aumento della temperatura / diminuzione, la durata della temperatura incremento / decremento) e permette studi comparativi. Inoltre, il protocollo può essere usato per studiare l&#39;influenza del sistema PQC sulla risposta allo stress termico. L&#39;attività dei componenti può essere modulata cambiando livelli di espressione utilizzando strumenti genetici come knock-out o sovraespressione o utilizzando disponibili in commercio inibitori specifici 6. Il proteasoma può essere inibita aggiungendo MG132 (100 mM) o lactacistina (10 pM) per mezzo di crescita. Il chaperone Hsp90 può essere inibita mediante geldanamycin (6 micron) o radicicol (10 micron). Il chaperone Hsp70 può essere inibita con VER-155088, anche se non siamo riusciti a confermare l&#39;efficacia di inibizione nelle nostre impostazioni sperimentali finora. Inibitori dovrebbero essere aggiunti un giorno prima di imaging e le cellule sono incubate per 14 ore. Criti<html> CAL passaggi all&#39;interno del protocollo Il passaggio critico per la valutazione della perturbazione indotta dal calore è lo stato delle cellule prima dell&#39;esperimento di imaging. Studi in lievito hanno mostrato che le cellule acquisiscono la resistenza ad una varietà di stress ambientali durante la fase stazionaria 13. Abbiamo anche osservato risposta minimo per applicare lo stress da calore se D. cellule discoideum avevano raggiunto fase stazionaria prima di imaging. Pertanto, mantenendo un numero costante di cella &lt;5 x 10 5 cellule / ml è critica. Inoltre, il numero di cellule elevate possono indurre la transizione dal ciclo vegetativo di D. discoideum al ciclo di sviluppo, innescando così percorsi da fame, che potrebbero portare ad una diversa risposta allo stress da calore. Se il numero di cellule alti sono raggiunti in fase di recupero dopo lo stress da calore, lo streaming e le cellule aggregazione possono interferire con l&#39;analisi dei dati come le cellule si muovono fuori fuoco (vedi Figura 4). contenuto &quot;&gt; limitazione della tecnica La perdita di messa a fuoco è il collo di bottiglia del protocollo. Durante variazioni di temperatura, il piano focale può spostare drasticamente, che richiede rifocalizzazione manuale in un periodo di tempo immediatamente dopo la modifica della temperatura. Il salto nel fuoco può essere a volte troppo estremo da superare con autofocus software, soprattutto se il tempo tra i punti di tempo è alta. Tuttavia, se il microscopio utilizzato è dotato di un autofocus hardware, questa strozzatura può essere aggirato. Importanza della tecnica con rispetto a metodi esistenti In confronto con configurazioni esistenti, come l&#39;uso di camere climatizzate, scatole di incubazione a temperatura controllata che coprono gli obiettivi ei fase fasi microscopio o temperatura controllata e collari oggettive, l&#39;uso di una camera di raffreddamento fornisce un controllo più preciso del ambiente temperatura. Il Peltier-elemento nella camera di raffreddamento può mantenere una tem costante ed uniformetemperatura in tutto l&#39;apparato sperimentale. In configurazioni classiche, le differenze di temperatura locali potrebbero portare a risultati di osservazione diversi. Inoltre, può rispondere rapidamente e rapidamente ai cambiamenti indotti nella temperatura, mentre configurazioni classici adattano molto lentamente alle variazioni di temperatura indotte, in particolare l&#39;abbassamento della temperatura. Il Peltier-elemento nella camera di raffreddamento può anche coprire una gamma più ampia di temperatura (15-40 ° C) rispetto configurazioni classici, con le temperature che raggiungono come 15 ° C o 40 ° C è molto difficile. Dictyostelium discoideum è particolarmente sensibile alla foto-tossicità. Precedenti studi utilizzati ascorbato come spazzino per ridurre la foto-tossicità. Tuttavia, i periodi di imaging lunghi richiedono integrazione aggiuntiva. Inoltre, l&#39;uso di ascorbato è limitata a studi in cui il meccanismo di interesse non è influenzato dal supplemento antiossidante. Si propone che l&#39;imaging temperatura controllata può essere utilizzata come alternativa ca.oach per minimizzare fototossicità e potrebbe essere combinata con l&#39;aggiunta di ascorbato di diminuire ulteriormente la tossicità. effetti fototossiche possono essere minimizzati fornendo una temperatura costante ed uniforme di 23 ° C utilizzando una camera di raffreddamento. Le cellule ripreso con controllo della temperatura mostrano meno segni di foto-tossicità, quali l&#39;arrotondamento delle cellule, per un periodo di tempo più lungo. Questo permette anche di imaging con intensità elevate, intervalli di tempo più o più campi di vista (FOV). Applicazione generale Stress termico a temperature superiori ha dimostrato di innescare calore diversa risposta allo stress 14. Pertanto, aumentando la temperatura a 34 ° C o 37 ° C potrebbe indurre una risposta differente. Oltre allo stress temperatura applicata, la durata di una particolare situazione di stress può essere modificato per studiare la risposta immediata o adattamento a lungo termine per stress termico. In generale, il protocollo descritto può essereesteso a una vasta gamma di applicazioni. Poiché il controllo preciso della temperatura riduce considerevolmente effetti foto-tossico, il protocollo può essere utilizzato in ambienti che richiedono elevati tempi di esposizione e / o elevate intensità di luce di eccitazione, per esempio, per la visualizzazione di proteine con un livello di espressione basso, o in combinazione con brevi intervalli di tempo tra le immagini, ad esempio, durante il time-lapse imaging. Può anche essere vantaggioso per immagini di oggetti che coprono tutta la cella, ad esempio, microtubuli, come queste impostazioni richiedono un elevato numero di z-sezioni ottiche.

Dictyostelium discoideum sono solitari amebe vivente terreno che si nutrono di batteri e altri microrganismi, che sono presi da fagocitosi. Ha un ciclo di vita unico e straordinario che è stato un importante settore di ricerca dalla sua scoperta 1. Il precoce interesse per lo sviluppo multicellulare 2 e le basi molecolari della chemiotassi 3 fu presto completata da studi incentrati sulla motilità cellulare, la polarità delle cellule, immunità innata. Inoltre, D. discoideum è stato introdotto come sistema modello per 4,5 ricerca biomedica. Recentemente, abbiamo stabilito D. discoideum come un nuovo sistema per studiare il sistema di controllo della qualità delle proteine (PQC) 6,7. Il suo proteoma è arricchito in proteine prioniche come aggregazione a rischio, che rappresenta una sfida per il controllo della qualità delle proteine 8. Per studiare se D. discoideum ha sviluppato meccanismi molecolari speciali per controllare il suo altamente agCongregazione incline proteoma, abbiamo studiato il comportamento delle proteine ​​marker di aggregazione a rischio sia in normali condizioni colturali e durante lo stress. Condizioni di stress, come ad esempio lo stress da calore, può essere utilizzato per aumentare il tasso di proteine misfolding 9. Pertanto, abbiamo cercato un sistema in cui siamo riusciti a indurre cambiamenti di temperatura e contemporaneamente seguire il comportamento delle proteine ​​marker. A questo scopo, abbiamo combinato live-cell imaging con riscaldamento Peltier controllato utilizzando un (camera di raffreddamento) inserto fase termica. Questo metodo ha permesso di mantenere una temperatura costante ed uniforme, così da indurre un cambiamento rapido ma preciso della temperatura. Live-cell imaging viene utilizzato per studiare una varietà di processi biologici in D. discoideum. Tuttavia, questo approccio deve affrontare due limiti importanti. Innanzitutto, le cellule mostrano un&#39;alta motilità e tendono a migrare fuori del campo di vista, inseguimento quindi delle singole celle spesso richiede l&#39;imaging di una grande area. La mobilità delle cellule puòessere ridotto di agar di copertura 10, tuttavia, tali condizioni non sono adatti per l&#39;imaging a lungo termine a causa di un calo della redditività. In secondo luogo, D. cellule discoideum mostrano una particolarmente elevata sensibilità a foto-tossicità, che si traduce in arrotondamento cellulare e arresto mitotico 11. Precedenti protocolli affrontato questo problema con l&#39;aggiunta di acido ascorbico come scavenger di radicali e la riduzione dei tempi di esposizione 12. Quest&#39;ultimo può essere critico se la proteina di interesse è espressa a livelli bassi e mostra un segnale debole fluorescenza. Gli autori suggeriscono anche di fornire una temperatura costante di 21 ° C sia per l&#39;imaging in una stanza con aria condizionata o utilizzando le caselle di incubazione a temperatura controllata, che coprono l&#39;obiettivo e microscopio fase 12. Qui, si descrive un metodo con un migliorato controllo della temperatura utilizzando una camera di raffreddamento impostato a 23 ° C. Durante l&#39;imaging nostro set-up migliora in modo significativo la resistenza alla foto-tossicità. essoconsente l&#39;utilizzo di tempi di esposizione più elevati e superiori intensità di luce di eccitazione. Questo è di particolare importanza durante time-lapse imaging, come gli intervalli di tempo devono essere attentamente bilanciata rispetto al numero di posizioni imaged e il tempo di esposizione utilizzato. La possibilità di aumentare il numero di posizioni impressi permette anche la copertura di un&#39;area più ampia di imaging e facilita il monitoraggio delle singole celle in un periodo di tempo più lungo.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Il protocollo di imaging descritto può essere utilizzato per analizzare il comportamento di proteine prioniche come aggregazione a rischio in un&#39;ameba D. discoideum durante stress termico. La Figura 1 mostra la distribuzione di Q103 proteine polyglutamine GFP-etichettato in cellule normali condizioni colturali (Figura 1A), dopo 2 ore di stress termico a 30 ° C (Figura 1B) e dopo 6 ore di recupero stress e crescita a normali condizioni di crescita (Figura 1C). Su aumento della temperatura da 23 ° C a 30 ° C, il marcatore Q103-GFP fonde da una distribuzione diffusa per puntiformi strutture. Dopo il rilascio di stress e la crescita a temperatura normale, queste strutture si dissolvono. La ridistribuzione di Q103-GFP e la formazione di calore indotta da stress citosolico foci possono essere quantificati utilizzando l&#39;analisi dell&#39;immagine. La figura 2A mostra l&#39;analisi dei singoli FOV utilizzando Fiji e il plugin &quot;Cell contatore &quot;. La figura 2B mostra la quantificazione della risposta allo stress termico. Questo dimostra che l&#39;aumento di focolai Q103-GFP citosolico in numero con continuo stress da calore. Durante lo stress da calore, il sistema (PQC) il controllo della qualità delle proteine è sopraffatto, quindi aggregation- proteine inclini come la Q103 proteina prionica-simili non possono essere mantenute in uno stato solubile e sempre aggregata foci citosolico. le cellule mostrano anche un arrotondamento caratteristica, come illustrato nella Figura 1B. la riduzione dei foci citosolico dopo la rimozione di stress suggerisce che l&#39;aggregato le proteine ​​sono dissolti. La qualità delle immagini è sensibile alla densità cellulare iniziale. Figura 3 mostra un esempio di cellule dopo il recupero stress, confrontando appropriata densità iniziale delle cellule (Figura 3A) e alta densità iniziale delle cellule (Figura 3B). Se la densità cellulare iniziale era troppo elevato, le cellule stellata per formare flussi come illustrato in figura 3b. Ciò che impone difficoltà sul successiva quantificazione come le cellule hanno spostato fuori del piano focale. Il metodo descritto può essere utilizzato per monitorare le variazioni di temperatura indotte come descritto sopra. Può anche essere utilizzato per ridurre fototossicità quando l&#39;imaging a temperatura crescita fisiologica. Figura 4 mostra un confronto di cellula ripreso a 23 ° C in una camera di raffreddamento (figura 4A) e cellule ripreso senza controllo della temperatura in una camera climatizzata, impostare a 25 ° C (Figura 4B). Al momento l&#39;esposizione costante alla luce di eccitazione, le cellule completano il quadro quando non è ripreso in condizioni di temperatura controllata. Questo cambiamento di forma delle cellule indica stress. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> Figura 1: <sTrong&gt; proteine prioniche come aggregazione inclini cambiare la loro distribuzione cellulare durante lo stress termico. GFP-tagged ricco di poliglutamine huntingtina esone 1 (Q103) è costitutivamente espresso in AX2-214 D. cellule discoideum (segnale GFP raffigurato nella tabella di ricerca invertito scala di grigi). (A) In condizioni normali di crescita a 23 ° C, Q103-GFP è diffuso distribuita nel citoplasma. (B) Dopo 2 ore di stress da calore a 30 ° C, Q103-GFP fonde in focolai citosolico (frecce rosse). Le cellule mostrano una caratteristica cambiamento di forma e completano. (C) Al rilascio stress e crescita a 23 ° C, il foci citosolico vengono disciolti. Dopo 6 ore, senza foci citosolico può essere osservato. Barra di scala = 10 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 2: Quantificazione di formazione foci citosolico indotta dal calore (A) Analisi delle cellule con il pacchetto di elaborazione delle immagini gratuito Fiji e il plugin &quot;Cell Counter&quot;.. La quantità totale di cellule (tipo 1, contro i marcatori blu) viene determinata l&#39;immagine in campo chiaro a. I marcatori sono caricati nel GFP-canale e il numero di cellule con citosolica focolai (tipo 2, marcatori da banco rosso) è determinata. (B) Quantificazione dei focolai dopo 3 ore di stress da calore a 30 ° C e 3 ore di recupero dello stress a 23 ° C (n = 4 campi di vista, errore bar = SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figura 3: Effetto della densità cellulare in time-lapse imaging a lungo termine Cells (A) impressi a densità cellulari iniziali &lt;10 5 cellule / ml.. Dopo 3 ore di stress termico a 30 ° C e 6 ore di recupero stress a 23 ° C, le cellule rimangono nel ciclo vegetativo e dividere. Solo poche cellule uscire dal piano focale. (B) Le cellule ripreso a densità cellulari iniziale&gt; 10 6 cellule / ml. Dopo 9 ore di immagini (impostazioni come in A), le cellule sono entrati nel ciclo di sviluppo e ha iniziato lo streaming e l&#39;aggregazione. Le cellule in aggregati non possono essere chiaramente distinti. Una gran parte di cellule esce dal piano focale e non possono essere analizzati. Barra di scala = 10 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; Figura 4:. Effetto di controllo di temperatura effetti fototossiche cellule (A) ripreso per 10 min a temperatura controllata a 23 ° C: 6 campi di vista, z-stack (spaziatura 0,5 mM, spessore del campione 8 mM), lasso di tempo (totale tempo 10 min, periodo 1 min), il canale GFP (0,07 msec tempo di esposizione, il 10% dell&#39;intensità del laser), canale RFP (0,1 msec tempo di esposizione, l&#39;intensità del laser 10%). Le cellule non mostrano segni dei cambiamenti morfologici caratteristici associati allo stress fototossico. (B) Le cellule ripreso per 10 minuti, senza controllo della temperatura (stesse condizioni in A). Le cellule mostrano segni di fototossicità indotta arrotondamento, che indica lo stress. Barra di scala = 10 micron. Le cellule sono stati ripresi in un sistema basato su un microscopio con un obiettivo 100x / 1.4 apertura numerica (NA). Le immagini sono state raccolte con una telecamera CCD da 1.024 x 1.024 pixel file utilizzando 1 x 1 binning.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Studiando la proteina del sistema di controllo di qualità di<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso Cellulare Imaging a temperatura controllata

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.4K Views.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

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Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other important cellular biology questions. The technologies available to genetically manipulate Dictyostelium cells are well-developed. Transfections can be performed using different selectable markers and marker re-cycling, including homologous recombination and insertional mutagenesis. This is supported by a well-annotated genome. However, these approaches are optimized for axenic cell lines growing in liquid cultures and are difficult to apply to non-axenic wild-type cells, which feed only on bacteria. The mutations that are present in axenic strains disturb Ras signaling, causing excessive macropinocytosis required for feeding, and impair cell migration, which confounds the interpretation of signal transduction and chemotaxis experiments in those strains. Earlier attempts to genetically manipulate non-axenic cells have lacked efficiency and required complex experimental procedures. We have developed a simple transfection protocol that, for the first time, overcomes these limitations. Those series of large improvements to Dictyostelium molecular genetics allow wild-type cells to be manipulated as easily as standard laboratory strains. In addition to the advantages for studying uncorrupted signaling and motility processes, mutants that disrupt macropinocytosis-based growth can now be readily isolated. Furthermore, the entire transfection workflow is greatly accelerated, with recombinant cells that can be generated in days rather than weeks. Another advantage is that molecular genetics can further be performed with freshly isolated wild-type Dictyostelium samples from the environment. This can help to extend the scope of approaches used in these research areas.

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is a popular model organism to study complex cellular processes such as cell migration, endocytosis, and development. The utility of the organism is dependent on the feasibility of genetic manipulation. Here, we present methods to transfect Dictyostelium discoideum cells that overcome existing limitations of culturing cells in liquid media.

Ingegneria genetica di Dictyostelium discoideum cellule basata sulla selezione e crescita sui batteri

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Ricerca

Genetica

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/Icm

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Immunologia e infezioni

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D Imaging di aggregazione proteica in cellule vive

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Biologia

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia di lievito di fissione del ciclo di vita sessuale

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

Rilevamento di localizzazione sottocellulare della proteina di verde fluorescenza della proteina Tagging e 4', 6-Diamidino-2-phenylindole macchiatura in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

Microscopia 4D del lievito

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally important for cell function and cell integrity of neurons. Drosophila photoreceptor cells have become a model for studying membrane protein trafficking. Besides rhodopsin, which upon illumination becomes internalized from the photoreceptor membrane and is degraded, the transient receptor potential-like (TRPL) ion channel in Drosophila exhibits a light-dependent translocation between the rhabdomeral photoreceptor membrane (where it is located in the dark) and the photoreceptor cell body (to which it is transported upon illumination). This intracellular transport of TRPL can be studied in a simple and non-invasive way by expressing eGFP-tagged TRPL in photoreceptor cells. The eGFP fluorescence can then be observed either in the deep pseudopupil or by water immersion microscopy. These methods allow detection of fluorescence in the intact eye and are therefore useful for high-throughput assays and genetic screens for Drosophila mutants defective in TRPL translocation. Here, the preparation of flies, the microscopic techniques, as well as quantification methods used to study this light-triggered translocation of TRPL are explained in detail. These methods can be applied also for trafficking studies on other Drosophila photoreceptor proteins, for example, rhodopsin. In addition, by using eGFP-tagged rhabdomeral proteins, these methods can be used to assess the degeneration of photoreceptor cells.

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Here, non-invasive methods are described for localization of photoreceptor membrane proteins and assessment of retinal degeneration in the Drosophila compound eye using eGFP fluorescence.

Studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando proteine con tag eGFP

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

Studiando la proteina del sistema di controllo di qualità di

Riepilogo

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Ingegneria genetica di Dictyostelium discoideum cellule basata sulla selezione e crescita sui batteri

Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/Icm

4D Imaging di aggregazione proteica in cellule vive

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine in ripiegamento

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Microscopia di lievito di fissione del ciclo di vita sessuale

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Rilevamento di localizzazione sottocellulare della proteina di verde fluorescenza della proteina Tagging e 4', 6-Diamidino-2-phenylindole macchiatura in Caenorhabditis elegans

Microscopia 4D del lievito

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