This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).

1. Preparazione del campione <ol><li> Crescere cellule di lievito di fissione che esprimono il marcatore palo fuso corpo sad1-mCherry 23 e di tipo II miosina catena leggera normativo Rlc1-pomodoro 24 in YE mezzi liquidi a 32 ° C per 8 generazioni. NOTA: per i mutanti sensibili alla temperatura, crescere le cellule a 25 ° C. Crescere le cellule a fase di mid-log a un OD 600 di 0,5 YE. Per maggiori informazioni sulla fissione condizioni di crescita del lievito si riferiscono al lievito di fissione manuale di laboratorio 25. </li><li> Preparate (o minimi) media con 0.6% agarosio (supporti basati agarosio mostrano sfondo meno fluorescenti rispetto alle agar). Per il supporto fuso aggiungere 1 mM di acido ascorbico (vitamina C). La vitamina C placa i radicali liberi che vengono rilasciati a causa di foto-sbiancamento, minimizzando così foto-tossicità. </li><li> Versare 3 - 4 ml di vitamina C cucita fuso media su di un piatto di cultura fondo di vetro. Lasciare raffreddare e solidificare i media. Notare laspessore del vetro nel piatto cultura dipende dallo spessore vetrino adatti per il microscopio. Qui, l&#39;uso vetrino No. 1.5. </li><li> alzare delicatamente il supporto solidificato dal piatto cultura con l&#39;aiuto di un bisturi affilato. Inserire un puntale tra la soletta media e piatto cultura per impedire la lastra di ricadere nel piatto (Figura 1). </li><li> Prendere 1 ml di cellule fresche che crescono come descritto al punto 1.1. Spin le cellule delicatamente a 300 xg per 30 s. Eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in piccola quantità di materiale residuo che rimane nel tubo dopo aver scartato il surnatante. </li><li> Carico 2 - 5 ml di coltura cellulare risospeso tra la soletta media e il fondo di vetro del piatto cultura. Le cellule devono essere sul vetro. La punta della pipetta posto tra i media e il piatto permette un facile caricamento della coltura cellulare. </li><li> Molto rimuovere delicatamente la punta della pipetta e posizionare la lastra dei media nella sua posizione originale sul cupiatto lture. Assicurati di evitare eventuali bolle d&#39;aria. Se necessario premere delicatamente le bolle d&#39;aria facendo scorrere la parte posteriore di un puntale sulla parte superiore della lastra media. </li><li> Lasciare le cellule siedono nel piatto di coltura per 30 minuti a un&#39;ora al buio a temperatura alla quale verrà eseguita microscopia. Questo è importante per evitare urti dovuti al cambiamento delle condizioni di crescita per le cellule. </li></ol> 2. Acquisizione di immagini <ol><li> Mettere una goccia di olio sul lato esterno del vetro sul piatto di coltura. Posizionare il piatto di coltura su un microscopio invertito. </li><li> Per ridurre al minimo automatica di fluorescenza di YE mezzi utilizzare un filtro GFP con una lunghezza d&#39;onda ristretta (520-535 nm). </li><li> Focus sul piano mediale delle cellule e garantire che essi sono ben distanziati e non troppo affollata. Assicurarsi di iniziare l&#39;acquisizione di immagini delle cellule nella fase adeguata del ciclo cellulare. Per questo esperimento, seguire le cellule da fine G2. </li><li> Programmare il software di acquisizione delle immagini to prendere GFP, RFP e le immagini DIC delle cellule. <ol><li> Per questo esperimento utilizzare il 100 ms tempo di esposizione per DIC e 75 ms tempo di esposizione per i filtri GFP e RFP. Il tempo di esposizione dipende dalle impostazioni del microscopio, la proteina in esame e la durata dell&#39;esperimento. Per le date impostazioni microscopio, utilizzare il 50% della potenza del laser. </li><li> Per catturare le immagini in 3 dimensioni, programmare il software di acquisizione di immagini per l&#39;imaging Z-scala. Utilizzare un passo di 0,4 micron e una distanza di 3,0 micron (metà del totale z) attorno al punto focale centrale delle cellule. Questo porta alla cattura di 16 Z fotogrammi al punto temporale con una distanza totale Z di 6 micron. NOTA: acquisizione delle immagini Z-series consente la cattura dei corpi polari mandrino. </li></ol></li><li> Prendere immagini ogni 2 min. Modificare il tempo di esposizione in base alle esigenze dell&#39;esperimento. Il tempo di esposizione può anche essere modificata in base alla proteina di interesse e la potenza del segnale. Si noti tuttavia che a breveer intervalli o tempo di esposizione incremento foto-tossicità dovuta allo sbiancamento e quindi cellule possono essere seguite solo per un breve periodo. </li><li> Acquisire le immagini fino a quando le cellule fisicamente separati come osservato dalle immagini DIC, o programmare il software per fermare l&#39;acquisizione dopo 90 min. </li></ol> Analisi 3. Immagine <ol><li> Analisi temporale degli eventi cytokinetic <ol><li> Utilizzando il software di acquisizione immagini fare proiezioni di Z-frame per ogni time-point. Rendere i file diversi per ogni lunghezza d&#39;onda di immagine acquisita. </li><li> Esportare questa serie di time-punto di proiezione in formato .tiff. </li><li> Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ. Aprire la serie di immagini per una qualsiasi delle lunghezze d&#39;onda. </li><li> Selezionare una cella da studiare. Fare doppio clic sull&#39;opzione linea di barra degli strumenti. Si aprirà una nuova finestra per regolare la larghezza della linea. Regolare la larghezza della linea per corrispondere alla larghezza della cella. Per una cella WT questo è di circa 40 - 50 pixel. Tracciare una linea lungo laasse lungo della cella di interesse. </li><li> Clicca su Analizza&gt; Strumenti&gt; Gestione ROI e fare clic su Aggiungi. Questo aggiungerà la linea selezionata nella finestra di ROI per un uso successivo. Non chiudere questa finestra. </li><li> Clicca sull&#39;immagine di interesse e selezionare Modifica&gt; Selezione&gt; Raddrizza. Si aprirà un&#39;altra finestra. Controllare &quot;Processo intero stack&quot;. Ciò raddrizzare il cellulare in orizzontale. </li><li> Clicca su Immagine&gt; Trasforma&gt; Ruota di 90 gradi a destra. Questa immagine viene ora raddrizzata verticalmente. </li><li> Clicca su Immagine&gt; Stack&gt; Crea Montaggio. Si aprirà una finestra per assegnare il numero di righe e colonne per la pila, il fattore di scala per la dimensione dell&#39;immagine, la prima e l&#39;ultima fetta (frame) per il montaggio e l&#39;incremento cornice per il montaggio. Controllare fette di etichette e premi invio. </li><li> Come viene mostrato una finestra con un montaggio della cella di interesse, aprire la serie di immagini per l&#39;altra lunghezza d&#39;onda. </li><li> Clicca sul identificatore line sul ROI manager. Questo selezioneràstessa cella sul secondo file di immagine. Ripetere i punti 3.1.6 - 3.1.8. Questo aprirà un montaggio della seconda immagine. </li><li> Sull&#39;immagine con il marcatore palo corpo mandrino sad1-mCherry, cercare insorgenza di separazione del marcatore pole corpo del mandrino e segnare quel punto di tempo come tempo 0. </li><li> Seguire il segnale Rlc1-pomodoro sull&#39;immagine nel tempo e cercare il segnale che appare come una linea distinta rispetto a macchie di Rlc1-pomodoro. Questa volta-punto segna il completamento del montaggio dell&#39;anello actomiosina / inizio della fase di maturazione. </li><li> Avanti scorrere il filmato nel corso del tempo per determinare quando l&#39;anello Rlc1-pomodoro inizia a diminuire in termini di dimensioni. Questo è contrassegnato come la fine della maturazione di fase / insorgenza di anello di costrizione. </li><li> Seguire il segnale Rlc1-pomodoro nel tempo durante costrizione finché non appare come un punto nel centro dell&#39;asse cella. Questo è contrassegnato come la fine di anello di costrizione / fine del setto ingression. </li><li> A seguito del montaggio di immagini DIC, determinare la cellula finaleseparazione. Registrare il punto di tempo in cui la cella separa fisicamente. </li><li> Per mandrino separazione polo corpo misurare la distanza tra i due corpi polari del fuso nel tempo utilizzando lo strumento della riga di ImageJ. Tracciare la distanza in corpo poli mandrino nel tempo. </li><li> Registrare i diversi punti temporali per i diversi eventi cytokinetic per calcolare la durata di ogni fase cytokinetic e confrontare con mandrino separazione corpo palo nel corso del tempo. </li></ol></li><li> Analisi spaziale di eventi cytokinetic <ol><li> Selezionare una cella con un anello actomiosina visibile. Fare doppio clic sull&#39;opzione linea di barra degli strumenti ImageJ. Si aprirà una nuova finestra per regolare la larghezza della linea. Regolare la larghezza della linea per corrispondere allo spessore dell&#39;anello (15 - 20 pixel). Tracciare una linea lungo l&#39;anello avendo cura di assicurare l&#39;intero spessore dell&#39;anello è incluso. </li><li> Clicca su Analizza&gt; Strumenti&gt; Gestione ROI e fare clic su Aggiungi. Questo aggiungerà la linea selezionata nella finestra di ROI per un uso successivo.Non chiudere questa finestra. </li><li> Clicca sull&#39;immagine di interesse e selezionare Modifica&gt; Selezione&gt; Raddrizza. Si aprirà un&#39;altra finestra. Controllare &quot;Processo intero stack&quot;. Questo raddrizzare l&#39;anello in senso orizzontale. </li><li> Ripristinare l&#39;intensità del piano luminoso nel z-stack raddrizzata (da 3.1.6) utilizzando Immagine&gt; Regola&gt; Luminosità / Contrasto&gt; Ripristina. </li><li> Fare clic sulla scheda Stk&gt; Progetto 3D. Si aprirà una finestra di dialogo. Cambiare il metodo di proiezione di Brightest Point e la spaziatura fetta di 2 o 3 pixel. Infine, l&#39;asse di rotazione del cambiamento a X o Y (questo cambierà a seconda dell&#39;angolo di visuale desiderata), fare clic su interpolare e fare clic su OK per generare una proiezione in 3D delle immagini. Utilizzare la barra di scorrimento sotto l&#39;immagine per ruotare l&#39;immagine. </li><li> Aprire la serie di immagini per l&#39;altra banda di frequenza con ImageJ. </li><li> Clicca sul identificatore line sul ROI manager. Questo selezionerà lo stesso anello sul secondo file di immagine. Ripetere i punti 4.2.4 e 4.2.5.Si aprirà un anello dimensionale 3 nell&#39;immagine con l&#39;altra lunghezza d&#39;onda. </li><li> Con i due anelli di immagini 3D aperte, cliccare su Immagine&gt; Colore&gt; Unisci canali. Si aprirà una scatola. Selezionare ogni immagine dal menu a discesa per il colore corrispondente desiderato verso il basso e fare clic su OK. Questo aprirà un composito di entrambe le immagini a diverse lunghezze d&#39;onda. </li><li> Confrontare la localizzazione di diversi marcatori per quanto riguarda la localizzazione presso l&#39;anello cytokinetic o membrana ingressing. Rlc1-GFP è un marker per l&#39;anello cytokinetic. Le proteine ​​co-localizzazione con Rlc1-GFP localizzano sul ring mentre le proteine ​​localizzazione dietro segnale Rlc1-GFP localizzare alla membrana ingressing. NOTA: La proteina di interesse deve essere di un fluoroforo diversa da quella del marcatore anello. </li><li> Generare 3 anelli tridimensionali durante le diverse fasi di cytokinesis per confrontare la localizzazione spaziale delle proteine ​​per tutto cytokinesis. </li></ol></li><li> Analisi di distri proteinebuzione in corrispondenza della tangenziale cytokinetic <ol><li> Per confrontare e analizzare la distribuzione delle proteine ​​lungo l&#39;anello misurare il coefficiente di variazione della distribuzione delle proteine. Un alto coefficiente di varianza indica distribuzione non uniforme delle proteine ​​lungo il sito divisione e suggerisce di montaggio anello improprio, la maturazione o la formazione del setto, a seconda di quale fase è ripreso e analizzato. </li><li> Utilizzando 3 dimensionale anello cytokinetic ricostruito (da 3.2.2), dividere l&#39;immagine in almeno 4 quadranti in modo tale che un quarto del ring appare in ogni quadrante. Per questo utilizzare lo strumento linea per disegnare linee perpendicolari sull&#39;immagine. Dopo ogni linea Clicca sull&#39;immagine&gt; Sovrapposizione&gt; Aggiungi selezione o utilizzare scorciatoia Ctrl + B. </li><li> Vai a Analizza&gt; set di misura. Selezionare valore di grigio medio nel dialogo che si apre. Fare clic su OK. </li><li> Utilizzando le linee tracciate sopra come guide disegnare un rettangolo per definire ogni quadrante con lo strumento rettangolo. </li><li> Per misurare l&#39;intensità media di ciascun quadrante, clicksu Analizza&gt; Misurare o utilizzare la scorciatoia Ctrl + M. </li><li> Registrare il valore di grigio medio per tutti i quattro quadranti (MG 1 -MG 4). </li><li> Seleziona una piccola area in ogni quadrante fuori dal ring come selezione sfondo. </li><li> Misurare valore di grigio medio per la selezione di sfondo per tutti i quattro quadranti (BG 1 -BG 4). </li><li> li&gt; Per sottrazione dello sfondo per ogni uso quadrante la seguente formulazione MG 1 -Average (BG 1: BG 4) = Intensità di anello in ogni quadrante (IRQ). In questa fase non sono 4 valori IRQ, uno per ogni quadrante. </li><li> Successivo calcolare il coefficiente di variazione per ogni anello utilizzando la seguente formulazione Deviazione standard (IRQ 1: IRQ 4) / medio (IRQ 1: IRQ 4). Calcolare medio coefficiente di varianza per ogni ceppo e confrontare agli altri ceppi. NOTA: un aumento statisticamente significativo coefficiente della varianza in un ceppo rispetto ai controlli Indicates irregolare proteina distribuzione / erogazione lungo il sito divisione in quella fase della citocinesi. </li></ol></li></ol>

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K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+dynamic+changes+of+multiple+cellular+components+during+the+yeast+cell+cycle+by+in+vivo+multivariate+Raman+imaging.">Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging.</a> Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).</li><li>Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+cps1+gene+provides+evidence+for+a+septation+checkpoint+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).</li></ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Qui abbiamo descritto un protocollo per studiare gli eventi cytokinetic in lievito di fissione in modo temporale. Il protocollo qui descritto fornisce risoluzione temporale di eventi diversi cytokinetic con riferimento l&#39;uno all&#39;altro; tempi di assunzione di proteine ​​o la perdita con riferimento alla fase di cytokinetic; Struttura dell&#39;anello durante le diverse fasi di citochinesi; e la progressione della citochinesi con riferimento alla mitosi. Con questo protocollo è possibile definire con precision...

Citocinesi, la fase finale di divisione cellulare, è un processo complesso indispensabile per il corretto differenziazione, lo sviluppo e la sopravvivenza di un organismo. Citochinesi coinvolge molteplici eventi che vengono organizzati per garantire il successo di separazione cellulare pur mantenendo l&#39;integrità genomica 1. Citochinesi comporta eventi in cui un anello actomiosina volta assemblato subisce costrizione, che è concomitante con l&#39;espansione della membrana e Assolcatore e rimodellamento della matrice extracellulare cellulare, infine seguita da abscission cella 1, 2, 3. Organizzazione improprio di eventi cytokinetic può portare a difetti di separazione cellulare e ploidia, e può causare malattie come il cancro 4, 5, 6, 7, 8. I principi fondamentali che consentono organizzazione di eventi cytokinetic non sono ben compresi, determinando in tal modo posti di blocco nella nostra comprensione della eziologia di queste malattie. Il pombe Schizosaccharomyces fissione lievito (S. pombe) è un sistema modello eccellente per studiare cytokinesis a causa della natura conservata delle proteine coinvolte 1. Nel lievito di fissione, dopo actomyosin gruppo ad anello, l&#39;anello entra in una fase di maturazione / di sosta dove non costrizione 9. Maturazione termina con l&#39;inizio di costrizione anello actomiosina, in concomitanza con Assolcatore membrana e setto ingression. Lavoro seminale nel corso degli anni ci hanno dato una discreta comprensione di assemblaggio dell&#39;anello actomiosina nel lievito di fissione 1, 9, 10. In alcuni eucarioti, compreso lievito di fissione, di successo assemblaggio dell&#39;anello actomiosina non è sufficiente per Assolcatore membrana. in fissione lievito, anello di costrizione da solo non fornisce una forza sufficiente a superare la pressione di turgore interna per la formazione solco 11. Un modello recente indica che questa forza è invece fornita da setto ingression 11. In un altro modello, il ruolo di estensione membrana plasmatica è stato suggerito di contribuire alla formazione solco 12, 13. Anello costrizione e Assolcatore membrana non si verificano in temperatura Bgs1 / CPS1 sensibile cps1-191 mutante, il principale enzima per la formazione del setto primaria 14, 15. Le cellule prive Bgs1 mostrano setto primaria difettosa e prolungata costrizione anello 15, 16. Bgs1 viene reclutato per il sito di divisione cellulare per setto ingressione durante la maturazione dopo actomiosina gruppo dell&#39;anello di 17, 18. Similarly, durante cellularization in embrioni di Drosophila, anello di costrizione è bifasica con un tasso di costrizione iniziale di rallentare significativamente 19, che assomiglia alla fase di maturazione osservato nel lievito di fissione. Bifasica costrizione anello potrebbe rallentare Assolcatore membrana per consentire l&#39;espansione della membrana sufficienti 20 e la modifica di matrice extracellulare. Ciò suggerisce che, dopo il montaggio actomyosin anello, anello di costrizione si verifica in modo efficiente solo quando la cellula ha soddisfatto i requisiti per la formazione del solco. Non è ben chiaro quali condizioni sono necessarie per costrizione anello actomiosina dopo l&#39;assemblaggio anello, né gli eventi molecolari che regolano questo processo. Abbiamo recentemente dimostrato che in seguito anello actomiosina assemblaggio piccola GTPasi Cdc42 subisce un pattern di attivazione spazio-temporale unico 21. Questo modello è stabilito dal pattern di localizzazione unica dei fattori di scambio guanidina nucleotide Cdc42 (GEFs) che attivano Cdc42. Il GEF GEF1 localizza all&#39;anello actomiosina assemblato e favorisce l&#39;insorgenza di costrizione ring e setto ingressione, mentre scd1 localizza alla membrana che solca e promuove la normale formazione del setto. Troviamo che il pattern di attivazione Cdc42 istituito dalle sue GEFs portano alla regolazione degli eventi cytokinetic distinti. Per comprendere il meccanismo molecolare di eventi che alla fine portano alla separazione delle cellule dopo il montaggio anello actomiosina, si ha la necessità di seguire gli eventi cytokinetic distinti nel tempo e nello spazio. Nel lievito di fissione, cytokinesis prima prevede l&#39;assemblaggio dei nodi precursori attorno al nucleo, che alla fine reclutano la miosina di tipo II, la Formin Cdc12, e altre proteine ​​necessarie per il montaggio dell&#39;anello actomiosina. Per ora gli eventi cytokinetic distinti e fornire un quadro di riferimento, la separazione dei marcatori del corpo poli del fuso (formazione del fuso) è considerato come tempo 0 22. L&#39;assemblaggio di thanello actomiosina e può essere seguito da monitorare nel tempo l&#39;intensità di una proteina anello actomiosina fluorescently etichettato come il tipo II miosina catena leggera normativo Rlc1. Qui si descrive un approccio microscopico per analizzare diverse fasi di cytokinesis nel corso del tempo.

<table><tbody><tr><td>Yeast extract media</td><td>Sunrise Science Products</td><td>YES 225</td><td>0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SeaKem LE agarose, Lonza</td><td>50001</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottomed culture dish</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system</td><td>Visitech International, UK</td><td></td><td>with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image analysis software</td></tr></tbody></table>

spatiotemporal analysis of cytokinetic events in fission yeast

Citochinesi, il passo finale nella divisione cellulare è fondamentale per mantenere l&#39;integrità del genoma. Una corretta cytokinesis è importante per la differenziazione cellulare e lo sviluppo. Citochinesi comporta una serie di eventi che sono ben coordinati nel tempo e nello spazio. Citochinesi comporta la formazione di un anello actomiosina nel sito divisione, seguita dalla costrizione anello, formazione solco membrana ed extra rimodellamento della matrice cellulare. Il lievito di fissione, SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE (S. pombe) è un modello di sistema ben studiato, che ha rivelato con notevole chiarezza gli eventi iniziali in citocinesi. Tuttavia, non capiamo chiaramente come i diversi eventi cytokinetic sono coordinati spatiotemporally. Per determinare questo, si ha la necessità di analizzare i diversi eventi cytokinetic in grandi dettagli nel tempo e nello spazio. Qui si descrive un approccio microscopio per esaminare diversi ev cytokineticEnt in cellule vive. Con questo approccio è possibile in volta diversi eventi cytokinetic e determinare il momento del reclutamento di diverse proteine ​​durante cytokinesis. Inoltre, descriviamo protocolli di confrontare localizzazione delle proteine, e distribuzione nel sito di divisione cellulare. Questo è un protocollo di base per studiare citochinesi in lievito di fissione e può essere utilizzato anche per altri lieviti e sistemi fungine.

Cellule di lievito di fissione che esprimono il marcatore anello, Rlc1-GFP (green, Figura 2) e il mandrino marcatore palo corpo sad1-mCherry (rosso, figura 2) sono stati ripresi durante cytokinesis. L&#39;insorgenza di marcatore palo corpo mandrino (freccia bianca, figure 2A, B) è considerato come tempo 0. segnale Rlc1-GFP appare al momento -4 min con riferimento al mandrino separazione corpo palo (freccia rossa, figure 2A, 2B). Segnale...

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Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Il lievito di fissione, SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE è un sistema modello eccellente per studiare citocinesi, la fase finale nella divisione cellulare. Qui si descrive un approccio microscopio per analizzare i diversi eventi cytokinetic in cellule fissione lieviti vivi.

Analisi spazio-temporale di Cytokinetic Eventi in lievito di fissione

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

spatiotemporal-analysis-of-cytokinetic-events-in-fission-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Views.  University of Tennessee.  Il lievito di fissione, SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE è un sistema modello eccellente per studiare citocinesi, la fase finale nella divisione cellulare. Qui si descrive un approccio microscopio per analizzare i diversi eventi cytokinetic in cellule fissione lieviti vivi. 

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Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Durata pannello misura replicazione in lievito

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine ​​cinetocoro e Motion cromosoma in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni sinciziale

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

L&#39;acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia di lievito di fissione del ciclo di vita sessuale

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

Live Cell Imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Analisi spazio-temporale di Cytokinetic Eventi in lievito di fissione

Riepilogo

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Durata pannello misura replicazione in lievito

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine cinetocoro e Motion cromosoma in Living

L'acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti

La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

Microscopia di lievito di fissione del ciclo di vita sessuale

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Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Live Cell Imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

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