Sincronizzando le cellule nella profase uno e quindi impoverendo la proteina bersaglio in una fase particolare, questo metodo può identificare funzioni temporaneamente distinte di proteine specifiche. L'esaurimento condizionale delle proteine in stadi specifici della miosi previene gli effetti residui che un mutante miotico tradizionale può avere negli stadi successivi. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per studiare la mitosi del lievito in erba e altri organismi che non subiscono la rottura dell'involucro nucleare.
Inoltre, questo metodo può essere utilizzato in altri organismi per studiare gli eventi del ciclo cellulare prima della rottura dell'involucro nucleare. Per iniziare, crea un pad di agar che verrà utilizzato per creare un monostrato di celle per l'imaging. Tagliare e scartare il tappo e il fondo di un terzo di un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri per creare un cilindro che fungerà da stampo per il cuscinetto di agar.
Posizionare il cilindro del tubo della microcentrifuga tagliato su un vetrino pulito con la parte superiore del tubo capovolta, seduto sul vetrino. Fare sei millilitri di una soluzione di agar al 5% in un becher da 50 millilitri. Tagliare la punta della pipetta per fare un'apertura più grande e pipettare circa 500 microlitri di agar fuso nel tubo della microcentrifuga.
Lasciare riposare a temperatura ambiente fino a quando l'agar si solidifica. Per preparare le cellule di lievito, centrifugare 200 microlitri della coltura di sporulazione a 800 G per due minuti in provette da microcentrifuga da un millilitro. Scartare 180 microlitri di surnatante.
Risospendere il pellet nel surnatante rimanente ruotando e facendo scorrere il tubo. Pipettare sei microlitri delle cellule concentrate sul coperchio scivolare al centro della camera sul posto con ConA. Tenere il cilindro con il cuscinetto di agar e farlo scivolare con attenzione dal vetrino.
Assicurarsi che l'agar sia completamente piatto nella parte inferiore e, utilizzando il fondo della punta della pipetta, applicare una leggera pressione allo stampo della microcentrifuga in modo che il tampone di agar venga spinto leggermente al di sopra del bordo del tubo. Quindi, capovolgere lo stampo in modo tale che il pad di agar sia rivolto verso il basso verso la camera. Utilizzare una pinza per posizionare delicatamente il cuscinetto di agar sopra le celle e la punta della pipetta per far scorrere delicatamente il cuscinetto di agar intorno alla camera da 10 a 20 volte per creare un monostrato di celle sul vetrino del coperchio.
Tenere il pad di agar nella camera per 12-15 minuti. Quindi, trasferire due millilitri di coltura di sporulazione in due tubi di microcentrifuga e girare a 15.700 G per due minuti. Dopo aver trasferito il surnatante in provette di microcentrifuga pulite, ruotare di nuovo nelle stesse condizioni e raccogliere il surnatante per pulire i tubi della microcentrifuga.
Aggiungere due millilitri di surnatante a goccia nella camera contenente il cuscinetto di agar. Una volta che il liquido ha raggiunto la parte superiore della camera, il cuscinetto di agar molto probabilmente galleggerà. Rimuovere delicatamente il cuscinetto di agar con una pinza e gettarlo.
Posizionare una linguetta di copertura da 24 x 50 millimetri sulla parte superiore della camera per evitare l'evaporazione durante l'imaging. Per impostare il filmato sul microscopio, inserire il vetrino di copertina all'interno del supporto del vetrino. Far aderire l'argilla di stampaggio sul lato della sottoveste di copertura per tenerla salda nel supporto della slitta.
Aprire il software di acquisizione delle immagini. Utilizzare manopole di regolazione grossolane e fini per focalizzare le celle utilizzando DIC o campo luminoso. Nel menu principale del software di acquisizione immagini, fai clic su File, seleziona Acquisisci e verranno visualizzate quattro finestre.
Nella finestra denominata Resolve 3D, fare clic sull'icona del pallone Erlenmeyer. Si aprirà una finestra denominata Design Run Experiment, che contiene i controlli per impostare un esperimento per impostare un filmato time-lapse. Nella scheda Progettazione, passare alla scheda Sezionamento.
Selezionare la casella accanto a Sezionamento Z e impostare la spaziatura delle sezioni ottiche su un micrometro e il numero di sezioni ottiche su cinque. Successivamente, nella scheda Canali, fai clic sull'icona più e seleziona il canale appropriato. Quindi, seleziona la casella accanto a Immagine di riferimento e imposta la posizione Z al centro del campione dal menu a discesa.
Selezionare un valore di trasmittanza e tempo di esposizione dal menu a discesa. Nella scheda Time-lapse, selezionare la casella accanto a Time-lapse e immettere i valori per minuti e ore per identificare l'intervallo di tempo di acquisizione dell'immagine. Seleziona la casella accanto a Mantieni la messa a fuoco con la massima messa a fuoco per evitare la deviazione dello stage durante il filmato.
E nella scheda Punti, seleziona la casella accanto a Elenco punti visita. Nel menu principale, fare clic su Visualizza e selezionare Elenco punti. Spostare lo stage in un'area della camera che mostra un monostrato di celle.
Fare clic su Segna punto nella finestra Elenco punti. Sposta lo stage per selezionare da 25 a 30 punti senza sovrapposizioni per evitare di sovraesporre le celle e visualizzare ogni campo durante ogni corso di tempo. Nella finestra Elenco punti, selezionate Calibra tutto per impostare lo stato attivo finale per ciascun punto.
Nella scheda Esegui salvare il file nella destinazione appropriata nel computer. Nella finestra Esegui esperimento, seleziona il pulsante Riproduci per avviare il filmato. Apri il software Fiji.
Apri i canali DIC e mCherry. Ottieni una singola proiezione di intensità massima del canale mCherry facendo clic su Immagine, seguito da Pile e Progetto Z e seleziona Intensità massima dal menu a discesa. Per unire i canali DIC e mCherry in un'unica immagine, fai clic su Immagine, Colore e seleziona Unisci canali.
Seguire una singola cellula attraverso la meiosi. Dopo il completamento della meiosi II, registrare il numero di masse di DNA. Nelle cellule wild type con lo sfondo di ancoraggio, ci sono tipicamente quattro masse di DNA alla fine della meiosi II, che rappresentano i quattro prodotti della meiosi.
In una piccola frazione delle cellule, solo tre masse sono visibili dopo la meiosi II.Quando Ctf19-FRB è ancorato al momento del rilascio della profase I, circa il 47% delle cellule mostra più di quattro masse di DNA al completamento della meiosi, suggerendo un difetto nell'attaccamento di cinetocori e microtubuli. Con l'ancoraggio di Ctf19-FRB, sia dopo l'assemblaggio del cinetocoro, ma prima della meiosi I, sia dopo la meiosi II, circa il 16% delle cellule mostra masse di DNA aggiuntive. Una delle parti più importanti di questo protocollo è aggiungere il surnatante a goccia alla camera per evitare di interrompere il monostrato.
Inoltre, annotare il tempo necessario per prepararsi all'imaging per considerarlo nell'analisi. Cambiando le proteine impacchettate in modo fluorescente, questa procedura può essere utilizzata per rispondere alle domande riguardanti la durata del ciclo cellulare, la segregazione cromosomica, l'abbondanza proteica e la localizzazione delle proteine.
