This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).

1. Preparação da Amostra <ol><li> Cultivar células de levedura de fissão que expressam o marcador fuso pólo corpo Sad1-mCherry 23 e tipo de cadeia leve reguladora da miosina II Rlc1-Tomate 24 em meios líquidos YE a 32 ° C durante 8 gerações. NOTA: Para mutantes sensíveis à temperatura, crescer as células a 25 ° C. Cultivar células à fase mid-log a uma DO600 de 0,5 em YE. Para saber mais sobre a fissão condições de crescimento de levedura consulte o manual de laboratório levedura 25. </li><li> Preparai-vos (ou mínimos) de mídia com 0,6% de agarose (media baseados Agarose mostrar fundo menos fluorescente em comparação com agar). Ao meio de cultura derretido adicionar 1 mM de ácido ascórbico (vitamina C). A vitamina C extingue os radicais livres que são liberados devido ao foto-branqueamento, minimizando, assim, foto-toxicidade. </li><li> Pour 3-4 mL da vitamina C atado derretido meios para uma placa de cultura de vidro de fundo. Deixe o fresco de mídia e solidificar. Note oespessura do vidro no prato de cultura depende da espessura da lâmina de cobertura apropriada para o microscópio. Aqui, o uso lamela No. 1.5. </li><li> Suavemente elevar a meios solidificado a partir do prato de cultura com a ajuda de um bisturi afiado. Coloque uma ponta de pipeta entre a laje e meios da placa de cultura para evitar que a laje de cair de volta para o prato (Figura 1). </li><li> Tomar 1 ml de células em crescimento fresco como descrito em 1.1 acima. Girar suavemente as células a 300 xg durante 30 s. Descartar o sobrenadante. Ressuspender as células na pequena quantidade de material residual que permanece no tubo depois de descartar o sobrenadante. </li><li> Carga 2 - 5 ul da cultura de células ressuspenso entre a laje e a meios de comunicação com fundo de vidro da placa de cultura. As células devem estar sobre o vidro. A ponteira colocada entre a mídia e o prato permite o carregamento fácil da cultura de células. </li><li> Muito gentilmente remover a ponta da pipeta e coloque a laje de mídia de volta na sua posição original no cuprato LTURE. Certifique-se evitar quaisquer bolhas de ar. Se for necessário pressionar suavemente as bolhas de ar, fazendo deslizar a parte de trás de uma ponta de pipeta por cima da laje de meios de comunicação. </li><li> Deixe as células sentar-se no prato de cultura durante 30 minutos a uma hora no escuro à temperatura a que a microscopia será executada. Isto é importante para evitar qualquer choque devido a alterações nas condições de crescimento para as células. </li></ol> 2. Aquisição de Imagem <ol><li> Coloque uma gota de óleo sobre o lado exterior do vidro no prato de cultura. Colocar a placa de cultura sobre um microscópio invertido. </li><li> Para minimizar a auto fluorescência de meios YE usar um filtro de GFP com um intervalo de comprimento de onda estreito (520-535 nm). </li><li> Concentre-se no plano medial das células e garantir que eles estão bem espaçados e não muito lotados. Certifique-se de iniciar a aquisição de imagem das células na fase adequada do ciclo celular. Para esta experiência, siga as células a partir de finais G2. </li><li> Programar o software de aquisição de imagem to exame GFP, RFP e imagens DIC das células. <ol><li> Para esta experiência usar 100 tempo de exposição ms para DIC e 75 ms de tempo de exposição para filtros GFP e RFP. O tempo de exposição depende das configurações do microscópio, a proteína sob estudo e a duração da experiência. Para os dados configurações microscópio, use 50% da potência do laser. </li><li> Para capturar imagens em 3 dimensões, o programa do software de aquisição de imagem para imagens em escala Z. Usar um tamanho de passo de 0,4 um e uma distância de 3,0 m (metade do total Z) em torno do ponto do foco central das células. Isto leva à captura de Z-16 quadros por ponto de tempo com uma distância total de Z 6 um. NOTA: Z-série de aquisição de imagem permite a captura dos corpos polares de fusos. </li></ol></li><li> Captar imagens a cada 2 min. Mudar o tempo de exposição de acordo com as necessidades da experiência. O tempo de exposição também pode ser alterada de acordo com a proteína de interesse e a intensidade do sinal. No entanto, note que curtaer ou mais intervalos de tempo de exposição aumento foto-toxicidade devido ao branqueamento e, por conseguinte, as células podem ser seguidos apenas por um curto período de tempo. </li><li> Adquirir imagens até que as células separadas fisicamente como observado pelas imagens DIC, ou programar o software para parar a aquisição depois de 90 min. </li></ol> Análise 3. Imagem <ol><li> Análise temporal de eventos cytokinetic <ol><li> Usando o software de aquisição de imagem fazer projeções dos Z-quadros para cada ponto de tempo. Faça arquivos diferentes para cada comprimento de onda da imagem adquirida. </li><li> Exportar esta série ponto-tempo de projeção como um arquivo .tiff. </li><li> Analisar as imagens usando o software ImageJ. Abrir a série de imagens para qualquer um dos comprimentos de onda. </li><li> Seleccionar uma célula a ser estudada. Dê um duplo clique sobre a opção de linha de barra de ferramentas. Isto irá abrir outra janela para ajustar a largura da linha. Ajustar a largura de linha para corresponder à largura da célula. Para uma célula WT esta é de cerca de 40 - 50 pixels. Desenhar uma linha ao longo daeixo longitudinal da célula de interesse. </li><li> Clique em Analisar&gt; Ferramentas&gt; Gerenciador de ROI e clique em Adicionar. Isto irá adicionar a linha selecionada para a janela de ROI para uso posterior. Não feche esta janela. </li><li> Clique na imagem de interesse e selecione Editar&gt; Seleção&gt; Endireitar. Isto irá abrir outra janela. Marque a opção &quot;Processo pilha inteira&quot;. Isto irá endireitar a célula horizontalmente. </li><li> Clique em Imagem&gt; Transformar&gt; Girar 90 graus para a direita. Esta imagem está agora esticado verticalmente. </li><li> Clique em Imagem&gt; Pilhas&gt; Faça Montage. Isto irá abrir uma janela para atribuir o número de linhas e colunas para a pilha, o fator de escala para o tamanho da imagem, a primeira e última fatia (frame) para a montagem eo incremento quadro para a montagem. Verifique fatias de etiqueta e pressione enter. </li><li> Como uma janela com uma montagem de célula de interesse é mostrado, abrir a série de imagem para o outro comprimento de onda. </li><li> Clique no identificador de linha no gerenciador de ROI. Isso irá selecionara mesma célula no segundo arquivo de imagem. Repita os passos 3.1.6 - 3.1.8. Isto irá abrir uma montagem da segunda imagem. </li><li> Na imagem com o fuso de marcador de corpos polares de Sad1-mCherry, olhar para o início da separação do marcador de corpos polares de fusos e marcar esse ponto de tempo como tempo 0. </li><li> Siga o sinal Rlc1-tomate na imagem ao longo do tempo e olhar para o sinal que aparece como uma linha distinta em oposição a manchas de Rlc1-tomate. Este ponto de tempo marca a conclusão da montagem de anel actomiosina / início da fase de maturação. </li><li> Próximo de rolagem através do filme ao longo do tempo para determinar quando o anel Rlc1-Tomate começa a diminuir em tamanho. Esta é marcado como o fim da fase de maturação / início da constrição do anel. </li><li> Seguir o sinal Rlc1-Tomate com o tempo durante a constrição até que aparece como um ponto no meio do eixo de células. Esta é marcado como o fim do anel de constrição / fim de ingresso septo. </li><li> Após a montagem de imagens DIC, determinar o final de célulasseparação. Grave o ponto no tempo quando a célula separa fisicamente. </li><li> Para a separação do corpo polar do fuso medir a distância entre os dois corpos polares de fusos ao longo do tempo utilizando a ferramenta de linha em ImageJ. Traça-se a distância no corpo polar do fuso ao longo do tempo. </li><li> Registam-se os diferentes pontos de tempo para os diferentes eventos cytokinetic para calcular a duração de cada fase cytokinetic e comparar com separação de corpos polares de fuso ao longo do tempo. </li></ol></li><li> A análise espacial de eventos cytokinetic <ol><li> Escolha de uma célula com um anel visível actomiosina. Dê um duplo clique sobre a opção de linha de barra de ferramentas ImageJ. Isto irá abrir outra janela para ajustar a largura da linha. Ajustar a largura de linha para corresponder à espessura do anel (15 - 20 pixels). Desenhar uma linha ao longo do anel tendo o cuidado de assegurar que toda a espessura do anel está incluído. </li><li> Clique em Analisar&gt; Ferramentas&gt; Gerenciador de ROI e clique em Adicionar. Isto irá adicionar a linha selecionada para a janela de ROI para uso posterior.Não feche esta janela. </li><li> Clique na imagem de interesse e selecione Editar&gt; Seleção&gt; Endireitar. Isto irá abrir outra janela. Marque a opção &quot;Processo pilha inteira&quot;. Isto irá endireitar o anel horizontal. </li><li> Redefinir a intensidade do avião brilhante no z-stack endireitou (de 3.1.6) usando Image&gt; Adjust&gt; Brightness / Contrast&gt; Redefinir. </li><li> Clique na guia Stk&gt; Projeto 3D. Isto irá abrir uma caixa de diálogo. Alterar o método de projeção para Brightest Point e o espaçamento fatia de 2 ou 3 pixels. Finalmente, o eixo de mudança de rotação para X ou Y-axis (isso vai mudar dependendo do ângulo de visão desejado), clique em interpolação e clique em OK para gerar uma projeção 3D da imagem. Use a barra de rolagem abaixo da imagem para rodar a imagem. </li><li> Abrir a série de imagem para o outro comprimento de onda usando ImageJ. </li><li> Clique no identificador de linha no gerenciador de ROI. Isso irá selecionar o mesmo anel no segundo arquivo de imagem. Repita os passos 4.2.4 e 4.2.5.Isto vai abrir um anel de três dimensões na imagem com o outro comprimento de onda. </li><li> Com os dois anéis de imagem 3D abertos, clique em Imagem&gt; Cor&gt; Mesclar Canais. Isto irá abrir uma caixa. Selecione cada imagem a partir do menu para a cor correspondente desejado para baixo e clique em OK. Isto irá abrir uma composição de ambos as imagens em diferentes comprimentos de onda. </li><li> Comparar a localização de diferentes marcadores em relação à localização do anel cytokinetic ou membrana ingressing. Rlc1-GFP é um marcador para o anel cytokinetic. Proteínas co-localizar com Rlc1-GFP localizar ao anel enquanto que as proteínas localizando atrás sinal Rlc1 localizar-GFP para a membrana ingressing. NOTA: A proteína de interesse necessita de ser de um fluoróforo diferente do que a do anel de marcador. </li><li> Gerar 3 anéis dimensionais durante diferentes fases da citocinese para comparar a localização espacial das proteínas através de toda a citocinese. </li></ol></li><li> Análise de proteínas DISTRIbuição no anel cytokinetic <ol><li> Para comparar e analisar a distribuição de proteínas ao longo do anel medir o coeficiente de variação da distribuição da proteína. Um co-eficiente de alta variância indica distribuição desigual de proteínas ao longo do local de divisão e sugere montagem de anel imprópria, maturação ou a formação de septo, dependendo da fase em que é criada uma imagem ou analisado. </li><li> Utilizando 3 dimensional anel cytokinetic reconstruída (a partir de 3.2.2), dividir a imagem em pelo menos 4 quadrantes de tal modo que um quarto do anel aparece em cada quadrante. Para isso, use a ferramenta de linha para desenhar linhas perpendiculares na imagem. Depois de cada linha clique&gt; Overlay&gt; Adicionar seleção ou usar atalho Ctrl + B. </li><li> Ir para Analisar&gt; medição indicados. Escolha valor de cinza médio na caixa que se abre. Clique em OK. </li><li> Usando as linhas desenhadas acima como guias desenhar um retângulo para definir cada quadrante usando a ferramenta retângulo. </li><li> Para medir a intensidade média de cada quadrante, clique emem Analisar&gt; Meça ou use o atalho Ctrl + M. </li><li> Grave o valor de cinza médio para todos os quatro quadrantes (MG 1 -MG 4). </li><li> Escolha uma pequena área em cada quadrante fora do ringue como a seleção de fundo. </li><li> Medir valor de cinza médio para a seleção de fundo para todos os quatro quadrantes (BG 1 -bg 4). </li><li> li&gt; Para subtração de fundo para cada uso quadrante a seguinte MG formulação 1 -Média (BG 1: BG 4) = intensidade do anel em cada quadrante (IRQ). Nesta fase, há 4 valores de IRQ, um para cada quadrante. </li><li> Em seguida calcular o coeficiente de variação para cada anel com a seguinte Desvio padrão formulação (IRQ 1: IRQ 4) / Médio (IRQ 1: IRQ 4). Calcular média coeficiente de variação para cada estirpe e comparar com as outras estirpes. NOTA: Um aumento estatisticamente significativo da co-eficiente de variância numa estirpe em comparação com controlos Indicates desigual proteína de distribuição / entrega ao longo do local divisão nessa fase da citocinese. </li></ol></li></ol>

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K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+dynamic+changes+of+multiple+cellular+components+during+the+yeast+cell+cycle+by+in+vivo+multivariate+Raman+imaging.">Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging.</a> Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).</li><li>Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+cps1+gene+provides+evidence+for+a+septation+checkpoint+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar eventos cytokinetic em levedura de fissão de uma forma temporal. O protocolo aqui descrito fornece resolução temporal de diferentes eventos cytokinetic com referência um ao outro; calendário de recrutamento de proteínas ou perda com referência à fase de cytokinetic; estrutura do anel ao longo das diferentes fases de citocinese; e a progressão da citocinese com referência a mitose. Com este protocolo, é possível definir com precisão a fase cytokinetic que podem...

A citocinese, o passo final na divisão celular, é essencial um processo complexo para a diferenciação adequada, o desenvolvimento e sobrevivência de um organismo. Citocinese envolve vários eventos que são organizados para garantir a separação de células com sucesso, mantendo a integridade genômica 1. A citocinese envolve eventos em que um anel de actomiosina, depois de montado sofre constrição, que é simultâneo com a expansão da membrana e estrias, e remodelação da matriz celular extracelular, finalmente seguido por abscisão célula 1, 2, 3. Organização indevido de eventos cytokinetic pode levar a defeitos de separação de células e de ploidia, e pode causar doenças como câncer 4, 5, 6, 7, 8. Os princípios fundamentais que permitem SRGANIZAÇÃO de eventos cytokinetic não são bem compreendidos, conduzindo assim a bloqueios na nossa compreensão da etiologia destas doenças. A levedura Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) é um excelente sistema modelo para estudar a citocinese devido à natureza conservada das proteínas envolvidas 1. Em levedura, após actomiosina conjunto do anel, o anel entra em uma fase de maturação / pausa onde não contraem 9. Maturação termina com o início da constrição do anel actomiosina, concomitante com franzindo a membrana e ingresso septo. Trabalho seminal ao longo dos anos deram-nos uma boa compreensão do conjunto do anel actomiosina na fissão de levedura 1, 9, 10. Em alguns eucariotas, incluindo levedura de fissão, a montagem bem-sucedida do anel actomiosina não é suficiente para franzir membrana. na flevedura issão, anel de constrição por si só não fornece força suficiente para superar a pressão de turgescência interna para a formação do sulco 11. Um modelo recente indica que esta força é, em vez fornecido pelo septo ingresso 11. Noutro modelo, o papel da extensão da membrana de plasma tem sido sugerido para contribuir para a formação de sulco 12, 13. Constrição do anel e franzindo a membrana não ocorrem na temperatura Bgs1 / CPS1 cps1-191 mutante sensível, a principal enzima para a formação do septo primário 14, 15. Células sem Bgs1 mostrar septo primário defeituoso e prolongada constrição do anel 15, 16. Bgs1 é recrutado para o site da divisão celular para ingresso septo durante a maturação após actomiosina conjunto do anel 17, 18. Similarly, durante celularização em embriões de Drosophila, anel de constrição é bifásica com um significativamente lenta taxa de constrição inicial 19, assemelhando-se a fase de maturação observada em levedura. Constrição anel bifásica pode abrandar franzindo a membrana para permitir a expansão suficiente membrana 20 e a modificação da matriz extracelular. Isto sugere que, após actomiosina conjunto de anel, anel de constrição ocorre de forma eficiente apenas quando a célula tenha satisfeito os requisitos para a formação de sulco. Não está bem compreendido que as condições são necessárias para a constrição do anel actomiosina após a montagem do anel, nem os eventos moleculares que regulam este processo. Temos demonstrado recentemente que, após anel actomiosina montagem da pequena GTPase Cdc42 sofre um padrão de ativação espaço-temporal única 21. Este padrão é estabelecido pelo padrão de localização única dos factores de troca de nucleótidos de guanidina CDC42 (GEFs) que activam Cdc42. O GEF Gef1 localiza ao anel actomiosina montado e promove aparecimento da constrição do anel e ingresso de septo, enquanto SCD1 localiza na membrana franzindo e promove a formação normal septo. Nós achamos que o padrão de ativação Cdc42 estabelecida por seus GEFs levar à regulamentação de eventos cytokinetic distintas. Para entender o mecanismo molecular de eventos que, eventualmente, levar à separação de células após a montagem do anel de actomiosina, é preciso seguir os eventos cytokinetic distintas no tempo e no espaço. Em levedura, citocinese envolve primeiro o conjunto de nós precursoras ao redor do núcleo, que acabou por recrutar a miosina tipo II, o formin Cdc12 e outras proteínas necessárias para a montagem do anel actomiosina. Para tempo os eventos cytokinetic distintas e fornecem um quadro de referência, a separação de marcadores de corpos polares de fusos (formação do fuso) é considerado como tempo de 0 22. A montagem do the actomiosina anel pode ser seguida por monitorização ao longo do tempo a intensidade de uma proteína de anel de actomiosina fluorescente etiquetado, tais como o tipo de cadeia leve reguladora da miosina II Rlc1. Aqui nós descrevemos uma abordagem microscópica para analisar diferentes estágios de citocinese ao longo do tempo.

<table><tbody><tr><td>Yeast extract media</td><td>Sunrise Science Products</td><td>YES 225</td><td>0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SeaKem LE agarose, Lonza</td><td>50001</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottomed culture dish</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system</td><td>Visitech International, UK</td><td></td><td>with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image analysis software</td></tr></tbody></table>

spatiotemporal analysis of cytokinetic events in fission yeast

A citocinese, o passo final na divisão celular é crítica para a manutenção da integridade do genoma. cytokinesis adequada é importante para a diferenciação celular e desenvolvimento. A citocinese envolve uma série de eventos que são bem coordenados no tempo e no espaço. A citocinese envolve a formação de um anel de actomiosina no local de divisão, seguido de constrição do anel, a formação de sulco de membrana e remodelação da matriz extracelular. A levedura de fissão, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) é um sistema modelo bem estudado que revelou com clareza substancial dos eventos iniciais em citocinese. No entanto, nós não entendemos claramente como diferentes eventos cytokinetic são coordenadas espaço-temporalmente. Para determinar isso, é preciso analisar os diferentes eventos cytokinetic em grandes detalhes no tempo e no espaço. Aqui nós descrevemos uma abordagem microscopia para examinar diferentes ev cytokineticentos em células vivas. Com esta abordagem, é possível de tempo diferentes eventos cytokinetic e determinar o tempo de recrutamento de proteínas diferentes durante a citocinese. Além disso, descreve-se os protocolos para comparar localização de proteínas, e de distribuição no local de divisão celular. Este é um protocolo básico para estudar citocinese na levedura de fissão e também pode ser utilizado para outras leveduras e sistemas de fungos.

Células de levedura que expressam o marcador de anel, Rlc1-GFP (verde, Figura 2) e o fuso marcador de corpos polares de Sad1-mCherry (vermelho, Figura 2) foram fotografadas durante citocinese. O início de marcador de corpos polares de fusos (seta branca, as Figuras 2A, B) é considerada como o tempo 0. sinal Rlc1-GFP aparece no momento -4 min com referência à separação de corpos polares de fuso (seta vermelha, as Figuras 2A, 2B). S...

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Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

A levedura de fissão, Schizosaccharomyces pombe é um excelente sistema modelo para estudar a citocinese, a fase final na divisão celular. Aqui nós descrevemos uma abordagem microscopia para analisar diferentes eventos cytokinetic em células de levedura de fissão ao vivo.

Análise espacial e temporal da Cytokinetic Eventos na levedura de fissão

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

spatiotemporal-analysis-of-cytokinetic-events-in-fission-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K visualizações.  University of Tennessee.  A levedura de fissão, Schizosaccharomyces pombe é um excelente sistema modelo para estudar a citocinese, a fase final na divisão celular. Aqui nós descrevemos uma abordagem microscopia para analisar diferentes eventos cytokinetic em células de levedura de fissão ao vivo. 

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Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Biologia

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões Sincicial

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia do ciclo de vida sexual por fissão de levedura

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

Imagem latente viva da pilha para avaliar a dinâmica do sincronismo da metafase e do Fate da pilha depois das perturbações mitotic do eixo

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...