Studiando la funzione delle cellule caliciformi in coltura primaria, otteniamo preziose informazioni sui meccanismi alla base delle differenze basate sul sesso nella salute della superficie oculare. Abbiamo modificato il già consolidato metodo di coltura primaria delle cellule caliciformi congiuntivali eliminando gli ormoni e le sostanze estrogeniche dal sistema, consentendo un controllo più preciso dei livelli di ormoni sessuali. Questa modifica migliora l'accuratezza e l'affidabilità dei nostri risultati.
La misurazione intracellulare del calcio è un metodo per studiare la funzione delle cellule caliciformi sotto vari stimoli e le vie di segnalazione intracellulare innescate da ogni stimolo. La tecnica può essere estesa allo sviluppo di farmaci per le malattie della superficie oculare come l'allergia oculare, la malattia dell'occhio secco o la congiuntivite. Questa tecnica facilita lo screening dell'effetto di varie molecole sulle cellule caliciformi sotto specifici livelli ormonali.
Le persone che non conoscono questa tecnica spesso hanno difficoltà a separare il tessuto congiuntivale dal tessuto connettivo. Il nostro consiglio è quello di prestare molta attenzione alla consistenza e alle proprietà del materiale del tessuto. La congiuntiva dovrebbe essere elastica e semitrasparente, mentre il tessuto connettivo è solitamente di colore più chiaro e simile a una fibra di cotone.
Per iniziare, usando un bisturi sterile, tritare il tessuto congiuntivale umano in pezzi cubetti di un millimetro. In una piastra a sei pozzetti, seminare quattro pezzi in ciascun pozzetto contenente un millimetro di terreno RPMI completo. Assicurati di ancorare i pezzi alla piastra.
Incubare i pezzi di tessuto a 37 gradi Celsius, al 5% di anidride carbonica e al 95% di aria. Rinfrescare il terreno di coltura ogni due giorni. Dopo 72 ore dalla semina, rimuovere il tappo di tessuto e continuare l'incubazione fino a quando le cellule caliciformi raggiungono il 70-80% di confluenza.
Quindi, sciacquare le cellule con PBS e aggiungere lo 0,05% di tripsina EDTA per staccare le cellule dal fondo della piastra. Osservare il distacco cellulare al microscopio. E una volta che le cellule si staccano, aggiungi un terreno RPMI completo per disattivare la tripsina.
Centrifugare la sospensione cellulare a 150 G per cinque minuti e risospendere il pellet in un terreno RPMI privo di rosso fenolo. Quindi riseminare la sospensione cellulare su una piastra di coltura con fondo di vetro per la misurazione della concentrazione di calcio intracellulare. Per il caricamento di Fura-2 AM, aggiungere il tampone di bicarbonato Krebs-Ringer contenente lo 0,5% di HEPES, lo 0,5% di BSA e lo 0,5 micromolari di Fura-2 AM, otto micromolari di acido pluronico F127 e 250 micromolari di sulfinpirazone nel piatto inferiore di vetro contenente le cellule caliciformi.
Incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius, proteggendole dalla luce. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con tampone bicarbonato Krebs-Ringer contenente 250 micromolari sulfinpirazone. Per la misurazione della concentrazione intracellulare di calcio, posizionare la capsula contenente cellule caricate con Fura-2 sotto il microscopio.
Quindi aggiungere un ingrandimento di 200 volte. Individua un campo rappresentativo contenente da 20 a 50 celle. Utilizzando la funzione a mano libera, disegna un contorno attorno a ciascuna cella per distinguerla dalla fluorescenza di fondo e attendi che il software sottragga automaticamente la fluorescenza di fondo dalla misurazione.
Fare clic sul pulsante Avvia esperimento e attendere da otto a 15 secondi per determinare i livelli basali di calcio nelle cellule. Quindi aggiungere con cautela l'agonista colinergico carbachol e continuare a misurare per almeno 120 secondi o fino a quando i livelli di calcio non sono tornati al basale. Utilizzando la variazione della concentrazione di calcio intracellulare di picco, calcolare il livello basale medio di calcio in ciascuna cellula dai primi 8-15 secondi di misurazioni.
Rimuovere dal set di dati le cellule con un livello basale medio di calcio uguale o superiore a 500 nanomolari. Successivamente, calcola la concentrazione massima di calcio intracellulare per ogni cellula. Quindi sottrarre il valore del livello basale di calcio dalla concentrazione intracellulare massima misurata per la stessa cellula.
Infine, calcola la media della variazione del picco di concentrazione intracellulare di calcio per tutte le cellule in un piatto. La purezza delle cellule congiuntivali umane è stata confermata mediante colorazione immunofluorescente, utilizzando anticorpi specifici per i marcatori delle cellule caliciformi, citocheratina e lectina Helix pomatia 1. I risultati del test Fura-2 AM non hanno mostrato differenze significative tra le cellule incubate in RPMI privo di rosso fenolo con 1% di BSA e terreno RPMI completo.
Tuttavia, è stato osservato un aumento significativo della risposta intracellulare del calcio al carbacolo confrontando il gruppo del terreno RPMI avanzato con il gruppo completo del terreno RPMI. La cosa più importante è ottenere una coltura primaria di cellule a calice umano di densità cellulare sufficiente. Durante la crescita, assicurarsi che i pezzi di tessuto aderiscano alla piastra di coltura per un'efficace crescita.
I ricercatori hanno potuto esplorare il coinvolgimento di percorsi specifici applicando vari inibitori, prendendo di mira i recettori o le molecole di segnalazione alle cellule prima della stimolazione. Possono essere valutati anche altri parametri indicativi della funzione delle cellule caliciformi, come la secrezione di mucina e la disattivazione delle protein chinasi attivate dai mitogeni. Le misurazioni complementari forniscono una comprensione completa della risposta delle cellule caliciformi a diversi stimoli.
