Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della lesione cerebrale traumatica esplosiva e può essere utilizzato per migliorare i farmaci neuroprotettivi prima dell'uso di modelli in Vivo più complessi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza uno strumento di laboratorio per esporre il tessuto cerebrale di massa in vitro a un'onda d'urto utilizzando un protocollo di produttività semplice e alto che consente la creazione di una lesione riproducibile. In primo luogo, inserire sterili anelli in acciaio inossidabile su misura nei pozzali di una piastra a sei pozza.
Aggiungere quindi un mezzo sperimentale preri riscaldato privo di siero con ioduro di propidio ai pozzi assicurando che il livello di mezzo non raggiunga al di sopra della tacca dell'anello. Trasferire la piastra nell'incubatrice per un'ora per assicurarsi che il mezzo sia a 37 gradi Celsius prima che gli inserti di coltura tissutale vengano trasferiti. Dopo un'ora, trasferire inserti di coltura tissutale con fette organotipiche dai loro piatti di crescita sugli anelli nel piatto dei sei pozzi.
Fare un punto sul bordo dell'inserto a ore tre con una pennarello permanente per facilitare la restituzione degli inserti nella sua posizione originale, quindi etichettare ogni sei piastra del pozzo con un nome e una data univoci e fare una mappa dei pozzi di ogni piastra, nominando ogni bene con una lettera e ogni fetta nel pozzo con un numero in modo che ogni fetta abbia un identificatore univoco. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per assicurarsi che le fette siano a 37 gradi Celsius immediatamente prima dell'imaging. Un'ora dopo il trasferimento su un mezzo sperimentale, valuta lo stato delle fette imaging rapidamente ogni fetta singolarmente e in sequenza a bassa potenza.
Utilizzare un microscopio a fluorescenza dotato di un filtro di eccitazione ed emissione appropriato idealmente in una stanza buia o in una stanza con scarsa luce. Tenere il coperchio sulla piastra durante l'imaging. Una certa condensa può accumularsi all'interno del coperchio.
In questo caso, utilizzare brevemente un asciugacapelli sull'impostazione bassa all'esterno del coperchio. Assicurarsi che le condizioni di imaging siano identiche in giorni diversi e tra gli esperimenti. Al basale, le fette sane mostrano pochissima colorazione fluorescente.
Le fette che presentano aree di colorazione rossa densa indicano una redditività compromessa e dovrebbero essere escluse da ulteriori analisi. Per confronto, qui viene mostrata la fluorescenza della fetta ferita da esplosione a 72 ore. Subito dopo l'imaging, rimuovere un inserto di coltura tissutale dalla piastra dei sei pozzali e trasferire con cura l'inserto in un sacchetto sterile di polietilene contenente 20 millilitri di mezzo sperimentale prerifavorato bollato con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica.
Rimuovere con cura eventuali bolle d'aria e sigillare il sacchetto sterile torcendo la parte superiore e applicando un morsetto di plastica. Assicurarsi che ogni sacchetto sterile sia etichettato correttamente con la piastra e l'identificazione del pozzo. Dopo aver trasferito ogni inserto di coltura tissutale in un singolo sacchetto sterile, posizionare i sacchetti e le sei piastre del pozzo con mezzo sperimentale nell'incubatore Celsius di 37 gradi.
Dopo un'ora, imballare con cura i sacchetti sterili con gli inserti di coltura tissutale in scatole di plastica all'interno di una scatola regolata termicamente riempita con l'acqua ionizzata a 37 gradi Celsius. L'acqua deve mantenere le fette organotipiche a temperatura fisiologica durante tutto il protocollo di esposizione alle onde d'urto. Indossare stivali protettivi con dita in acciaio, un cappotto da laboratorio e guanti durante la preparazione del tubo d'urto e l'esposizione alle onde d'urto.
Utilizzare un'asta di tura per bullonare il telaio sterile del porta sacchetto alla flangia distale del tubo d'urto assicurando che il foro centrale sia allineato con l'uscita del tubo d'urto. Il sensore uno, un trasduttore di pressione, si trova nella parte centrale della sezione guidata e il sensore due si trova nella flangia distale del tubo d'urto. Collegare questi trasduttori di pressione a un oscilloscopio attraverso un'unità di alimentazione a fonte di corrente e accendere l'oscilloscopio.
Assicurarsi che la valvola solenoide del tubo d'urto e il controllo del flusso siano chiusi, quindi aprire la linea di aria compressa esterna e caricare la valvola solenoide a 2,5 bar. Aprire la valvola di sicurezza del cilindro dell'aria compressa e aprire lentamente il regolatore di pressione per aumentare la pressione a circa cinque bar. Successivamente, preparare i diaframmi tagliando fogli di poliestere spessi 23 micron in quadrati di 10 per 10 centimetri.
Preparare le maniglie dal nastro autoclave e attaccarle nella parte superiore e inferiore di ogni diaframma. Posizionare un diaframma nella violazione e assicurarsi che siano posizionati. Quindi, bloccare il diaframma utilizzando quattro bulloni e dadi M24.
Modellali in sequenza in modo diagonalmente simmetrico garantendo al contempo che i diaframmi siano senza rughe. Bloccare una borsa sterile in posizione verticale sul telaio del supporto assicurando che la superficie dell'inserto di coltura tissutale con le fette ippocampali organotipiche sia rivolta verso l'uscita del tubo d'urto e l'inserto di coltura tissutale sia centrato all'interno della borsa sterile. Per la configurazione a doppio diaframma, la pressione di scoppio dipende dal differenziale di pressione del gas tra il conducente e la camera a doppia rottura.
Pertanto, affinché i diaframmi esplodono in modo controllato, la valvola di sicurezza a doppia breccia viene aperta manualmente una volta raggiunte le pressioni target. Indossare otoprotettori e occhiali di sicurezza se non già indossati. Chiudere la valvola solenoide.
Accendere l'unità di alimentazione della sorgente corrente per acquisire i dati delle onde d'urto. Manipolare la manopola di controllo del flusso sul pannello di controllo del tubo d'urto per pressurizzare lentamente la sezione del volume del driver del tubo d'urto per la configurazione a diaframma singolo o sia la sezione del volume del driver che la sezione a doppia rottura del tubo d'urto per la configurazione a doppio diaframma. Non appena il diaframma si rompe, ha chiuso rapidamente il flusso di aria compressa utilizzando la manopola di flusso e ha aperto la valvola solenoide.
La combinazione ideale di parametri delle onde d'urto dovrebbe essere sufficiente a causare lesioni tissutali ma non così in alto da causare inserto di coltura tissutale o distorsione o rottura sterile del sacchetto. Dopo aver esposto ogni fetta a una singola onda del tubo d'urto, riportarla immediatamente alla scatola regolata termicamente. Quindi prendere la prossima borsa sterile dalla scatola e bloccarla sul telaio del supporto.
Eseguire l'interruttore senza intoppi e rapidamente per evitare il raffreddamento del mezzo sperimentale poiché temperature inferiori a 37 possono interferire con lo sviluppo di lesioni. Una volta che tutti gli inserti di coltura tissutale sono stati esposti a un protocollo d'onda d'urto o fittizio, restituire gli inserti di coltura tissutale nei loro pozzi nella piastra originale di sei pozza e tornare all'incubatrice fino a ulteriori immagini. Questa immagine è un esempio rappresentativo di un'onda d'urto ottenuta utilizzando pellicola di poliestere spessa 23 micron con sovrapressione di picco di 55 kilopascal.
La velocità dell'onda d'urto era di 440 metri al secondo. Sia le onde d'urto di sovrapressione di picco di 50 che di 55 kilopascal hanno causato lesioni significative che si sono sviluppate durante il protocollo di 72 ore rispetto al gruppo sham. L'infortunio derivante da un'esposizione all'onda di sovrapressione di picco di 55 kilopascal è stato significativamente superiore rispetto a dopo 50 kilopascal a 48 ore e 72 ore, dimostrando che lo sviluppo della lesione è proporzionale all'intensità dell'onda d'urto.
Questa immagine mostra una fetta 72 ore dopo un'esplosione di 50 kilopascal. È visibile un alto livello di lesioni diffuse. L'infortunio è più pronunciato dopo un'esplosione di sovrapressione di picco di 55 kilopascal.
Questa immagine di fluorescenza dello ioduro propidio mostra una fetta organotipico di un esperimento fittizio. La fetta fittizia mostra bassi livelli di fluorescenza. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere una tecnica aseptica in tutto per evitare la contaminazione del tessuto e manipolare le colture tissutali rapidamente ma molto delicatamente per evitare danni cellulari indesiderati.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la colorazione dell'immunofluorescenza al fine di rispondere a domande aggiuntive come quali sono i meccanismi di morte cellulare coinvolti nella lesione cerebrale traumatica indotta dall'esplosione? Questa tecnica consente un saggio ad alta produttività per i ricercatori nel campo della neuroprotezione per esplorare il potenziale dei farmaci per prevenire la diffusione della morte cellulare e del tessuto cerebrale dopo l'esposizione alle onde d'urto.
