Il nodo e la piastra notochordale sono organizzatori essenziali durante lo sviluppo embrionale del topo. Oggi descriveremo due tecniche utilizzate dai biologi dello sviluppo per visualizzare e studiare queste strutture. Nel primo protocollo, dimostreremo come eseguire l'elettro microscopia a scansione, SEM e nel secondo, immunofluorescenza a montaggio intero.
Il nodo e la piastra notochordale sono transitoriamente presenti sulla superficie dell'embrione al giorno embrionale E7.75, enfasi minuscole ciglia si proiettano verso l'esterno, che consentono la loro identificazione e visualizzazione da parte della SEM. In entrambi i protocolli, dimostreremo passi critici nella gestione degli embrioni di topo relativamente piccoli e ci concentreremo su come trasferirli e instradarli. Per iniziare, apri l'addome di un topo incinta eutanasiato attraverso la pelle e i mesenteries.
Usando forbici e forcep fini, rimuovere l'utero. Risciacquare brevemente l'utero in acqua distillata e posizionarelo in una piccola piastra di Petri contenente PBS. Quindi, utilizzare un microscopio sezionante e forcep fini per rimuovere i muscoli uterina per liberare i singoli decidui.
Al microscopio sezionato, tenere ogni decidua con un paio di forcep e utilizzare un'altra coppia per fare un'incisione longitudinale a pieno spessore tra la parte rossa e la parte bianca. Effettuare perforazioni superficiali verticalmente lungo la parte bianca della decidua, contigue all'incisione. Quindi, allontanare la decidua orizzontalmente in due metà e rimuovere con cura l'embrione dalla parte bianca della decidua.
Successivamente, trasferire gli embrioni in una nuova piastra di Petri contenente PBS filtrato sterile. Rimuovere la membrana di Reichert da ogni embrione, a partire dal cono ectoplacentare. Per il genotipizzazione futuro, rimuovere un piccolo pezzo del sacco vitellino.
Sotto una cappa chimica, trasferire gli embrioni su un tubo di microcentrifugo contenente fissivo di grado EM composto per il 2,5% da glutaraldeide e PBS filtrato sterile. Dopo questo, rimuovere il fissatore dal tubo senza disturbare gli embrioni. Lavare gli embrioni tre volte in PBS sterile e filtrato per 15 minuti a temperatura ambiente.
Disidratare gli embrioni in una serie di etanolo per cinque minuti ciascuno, utilizzando il 50%70% e l'85% di etanolo diluito in PBS. Lavare tre volte con etanolo al 100%. Conservare gli embrioni in etanolo al 100% a 20 gradi Celsius o procedere al passaggio successivo.
Successivamente, trasferire gli embroyos su un recipiente appropriato e rimuovere il liquido rimanente. Aggiungere HMDS ed etanolo ad un rapporto tra uno e uno agli embrioni per 30 minuti. Quindi, rimuovere il liquido e aggiungere HMDS puro per 30 minuti.
Rimuovere il liquido dagli embrioni con una pipetta e lasciare asciugare per 30 minuti. Utilizzare un piccolo pennello e nastro a doppia parte per montare gli embrioni essiccati su stub SEM, con i lati ventrali verso l'alto. Inserire gli stub in una macchina per il rivestimento dello sputter per il rivestimento di particelle d'oro.
Uno dei passaggi più delicati della particella SEM è il montaggio degli embrioni nell'orientamento corretto sullo stub. Una volta che l'embrione atterra sul nastro, l'orientamento non può più essere cambiato. Successivamente, posizionare gli stub rivestiti in un microscopio SEM, applicare un vuoto e osservare i nodi embrionali e le cellule della piastra notochordale con ciglia.
Dopo aver rimosso gli embrioni a E7.75, metterli in PBS Tween in una piastra di Petri sul ghiaccio. Sotto una cappa chimica, trasferire gli embrioni in un tubo di microcentrifugo contenente soluzione fissante. Dopo questo, rimuovere il fissatore dal tubo, facendo attenzione a non toccare gli embrioni.
Quindi, lavare gli embrioni tre volte in PBS contenente 0,2%Triton X-100 per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker nutating. Rimuovere l'ultimo lavaggio dagli embrioni e aggiungere la soluzione di blocco contenente PBS Triton, con siero inattivato al calore al 10%. Bloccare gli embrioni per almeno due ore su un nutatore a quattro gradi Celsius.
Quindi, rimuovere il blocco e aggiungere circa un millilitro di anticorpo primario diluito nella soluzione di blocco. Incubare gli embrioni durante la notte su un nutator a quattro gradi Celsius. Rimuovere l'anticorpo primario e salvarlo per un uso successivo.
Quindi, sciacquare gli embrioni con PBS Triton due volte. E lavarli tre volte per 30 minuti su un nutator. Sostituire il lavaggio con l'anticorpo secondario coniugato di florescence diluito contro la specie ospite dell'anticorpo primario.
E incubare durante la notte su un nutator a quattro gradi Celsius. Quindi, rimuovere l'anticorpo secondario e risciacquare gli embrioni con PBS Triton due volte. Prima di lavare tre volte per 30 minuti con PBS Triton.
Sostituire l'ultimo lavaggio con PBS Triton contenente falloidina coniugata a florescenza diluita e DAPI diluito e macchiare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, sciacquare gli embrioni due volte in PBS Triton. E lavarli con PBS Triton per 30 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, sostituire il PBS Triton con PBS e lasciare gli embrioni sul ghiaccio. Quindi preparare diapositive pulite e cariche positivamente, scivolamenti di copertura e mezzi di montaggio a base di glicerolo acquoso. Posizionare due pezzi di nastro chiaro a 15 millimetri l'uno dall'altro sullo scivolo.
Quindi, al microscopio di sezionazione, utilizzare una pipetta P200 modificata per spostare un embrione nella diapositiva. Usando forcep fini, fare due tagli completi sui lati laterali del sacco tuorlo per aprire l'embrione. Quindi, posizionare l'embrione con il lato ventrale verso l'alto.
Aggiungere 50 microlitri di supporti di montaggio all'embrione. Quindi, aggiungere un tampone di supporto di montaggio al coperchio. Posizionarlo a cavallo dei due pezzi di nastro adesivo e abbassarlo lentamente sugli embrioni usando un ago piegato.
Utilizzare una salvietta assorbente per rimuovere i supporti di montaggio in eccesso, facendo attenzione a non spostare lo slittamento del coperchio. Quindi, utilizzare una generosa quantità di smalto per sigillare i lati dello scivolo del coperchio. Infine, utilizzare un microscopio confocale a scansione per osservare gli embrioni.
È fondamentale non spostare lo slittamento della copertura dopo averli montati sugli embrioni, perché può distorcerli per la visualizzazione 3D. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, è stata osservata la formazione del nodo in embrioni di topo mutanti di tipo selvaggio e strisciare uno embrione di topo mutante a E7.75. A differenza del nodo a forma di fossa nel tipo selvaggio, gli embrioni mutanti mostravano un nodo appiattito e un nodo regolare e una placca nodalcordale.
Il tutto ora all'immunofluorescenza è stato utilizzato per studiare i difetti di formazione del nodo e delle lastre notoordali negli embrioni mutanti Strip 1 a livello cellulare. I dati hanno mostrato che erano anormali e stentata negli embrioni mutanti. Il nodo e la piastra nodalecortale sono presenti solo transitoriamente sulla superficie dell'embrione, quindi la tempistica è essenziale per il successo del SEM.
Ad esempio, da due a quattro embrioni di somite sono buoni per l'analisi SEM di un nodo maturo con ciglia lunghe. I reagenti di purezza sono anche essenziali per il successo di queste tecniche, specialmente nel sondare l'ultrastruttura da sem. Piccole impurità che si attaccano all'embrione di solito si traducono in enormi artefatti.
Crediamo che queste due tecniche diano informazioni complementari sulla struttura del nodo e della piastra nodalecortale durante il normale sviluppo e nei mutanti che mostrano difetti nella formazione di queste strutture.
