Ringraziamo il Dott. Giulio Di Minin per la derivazione delle linee phaESC e il Dott. Remo Freimann per il funzionamento della citometria a flusso. Riconosciamo anche la signora Michèle Schaffner e il signor Thomas M. Hennek per il supporto tecnico con il trasferimento di embrioni. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione nazionale svizzera per la scienza (grant 31003A_152814/1).

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La clonazione dei mammiferi mediante trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) è stata introdotta negli anni'90 19,20,21. Questi sviluppi hanno fatto seguito a studi di clonazione condotti 30 anni prima inanfibi 22. Il notevole ritardo riflette la difficoltà dell'embriologia e dell'imprinting genomico nei mammiferi. Lo sviluppo di SCNT di mammiferi è la base per l'applicazione dell'haESC per sostituire lo sperma, che è dettagliato in questo protocollo.
La sincronizzazione del ciclo cellulare è un fattore importante per il successo di SCNT23. Questo vale anche per l'iniezione di haESC in questo protocollo. L'introduzione di un genoma donatore in un ricevente richiede che le fasi del ciclo cellulare siano abbinate per evitare rotture cromosomiche o aneuploidie che abrogano lo sviluppo dell'embrione. La semiclonazione ha l'ulteriore complessità che due genomi e un citoplasto devono essere compatibili. Una precedente relazione ha dimostrato che l'iniezione di ESESC androgenetici arrestati in fase di m ha prodotto tassi di sviluppo migliori di embrioni semi-clonati rispetto all'iniezione di ESESC in fase G1 negli ovociti7. Questo rapporto suggerisce la fase M come punto di sincronizzazione adatto per la semiclonazione. Di conseguenza, i faESC sono stati arrestati mitoticamente in metafase con demecolicina e iniettati nell'ooplasma degli ovociti MII, che sono stati naturalmente arrestati nella metafase II di meiosi. È importante sottolineare che l'arresto in fase M può essere raggiunto negli ESC dei topi con alta efficienza, fornendo un'eccellente sincronizzazione tra i cicli cellulari del donatore e del ricevente.
Durante la mitosi, la membrana nucleare si rompe e si forma un mandrino a cui si attaccano i cromosomi replicati. Dopo l'iniezione di DKO-fasi M, i cromatidi sorelle vengono segregati in un corpo pseudo polare e nello zigote7 (Figura 3E). Di conseguenza, un singolo insieme di cromosomi di un DKO-phaESC contribuisce all'embrione semi-clonato. È fondamentale che le cromatidi sorelle dei cromosomi DKO-phaESC possano essere correttamente segregate dopo l'iniezione. La membrana plasmatica di un DKO-phaESC intatto previene la segregazione in un corpo pseudo polare. Abbiamo infatti osservato rari casi in cui la membrana plasmatica dei DKO-faSE non è stata interrotta e gli embrioni hanno mostrato DKO-faESC intatti nell'ooplasma dopo l'iniezione (Figura 3D). Pertanto, è necessario fare attenzione a rimuovere la membrana plasmatica dei DKO-faSCI mediante pipettazione. Durante l'iniezione, è altrettanto importante evitare l'interruzione del mandrino meiotico dell'ovocita, che potrebbe portare a difetti di segregazione cromosomici e indurre anche l'aneuploidia.
Nei mammiferi, l'imprinting genomico limita l'applicazione dei fasesci come sostituzione dello sperma. Gli haESC partenogenetici possiedono una configurazione materna delle impronte genomiche, mentre gli spermatozoi possiedono una configurazione paterna. Pertanto, la generazione di cuccioli a tempo pieno non si è verificata dopo l'iniezione di faESC di tipo selvatico come sostituzione dello sperma. Per superare questa limitazione, le eliminazioni dei DLF IG- e H19- sono progettate in fasi. La modifica dell'espressione impressa nei loci materni Igf2-H19 e Gtl2-Dlk1 è sufficiente per cambiare la configurazione delle impronte genomiche per consentire la generazione di topi semi-clonati con una frequenza superiore al 5,1%, basata su embrioni trasferiti a 2 cellule. Queste osservazioni suggeriscono che il targeting di due geni impressi commuta il genoma dei faESC in una configurazione paterna funzionale in grado di sostituire lo sperma nei topi. Tuttavia, per questa strategia è necessaria una modificazione genetica permanente dei FASC. Come strategia alternativa, si può prendere in considerazione l'haESC androgenetico. Gli haESC androgenetici derivano dal genoma dello sperma e possiedono impronte patene. Ci sono stati rapporti che gli haESC androgenetici di tipo selvatico hanno contribuito come sostituto dello sperma a generare cuccioli a lungo termine a una frequenza compresa tra l'1,3% e l'1,9%degli embrioni trasferiti 4,7,24. I cuccioli a tempo pieno sono stati ottenuti anche iniettando haESC androgenetici con deprezzazioni dei DR IG- e H19- ad una frequenza del 20,2% degli embrioni a 2 celluletrasferiti 24. L'aumento dell'efficienza della semiclonazione mediante haESC androgenetici modificati è probabilmente dovuto al fatto che le impronte possono diventare instabili nella cultura. I difetti di imprinting sono corretti dalle deiezioni genetiche dei D DMR critici.
Considerando la difficoltà di introdurre modifiche genetiche direttamente nei genomi degli ovocati o degli spermatozoi, gli ESES sono uno strumento prezioso per manipolare separatamente i genomi parentali. L'uso degli haESC come sostituto dello sperma offre un notevole vantaggio per l'editing del genoma nella linea germinale del topo. Un recente studio ha combinato l'editing del genoma basato su CRISPR / Cas9 con l'applicazione di haESC per la caratterizzazione delle regioni di imprinting che sono fondamentali per lo sviluppo embrionale12. Questo studio ha analizzato il ruolo del Rasgrf1-DMR in combinazione con i DMC H19e IGnello sviluppo di topi bimaternali e la funzione di 7 diversi DMC nello sviluppo di topi bipaternali. Il metodo per sostituire gli ESESC con lo sperma ha costituito la base per approcci di screening genetico per identificare gli amminoacidi chiave all'interno della proteina DND1 nello sviluppo primordiale delle cellule germinali e per identificare i geni nellosviluppo osseo 24,25,26. Studi sull'imprinting genomico e sullo screening genetico per identificare i fattori chiave nello sviluppo embrionale sono approcci considerevoli per l'applicazione degli eSESC come genomi gametici.

Nei mammiferi, i gameti sono le uniche cellule che trasmettono informazioni genetiche alla prossima generazione. La fusione di un ovocita e di uno spermatozoo forma uno zigote diploide che si sviluppa in un animale adulto. Le mutazioni nei genomi gametici sono quindi ereditate dalla prole e guidano la variazione genetica nellaspecie 1. L'introduzione di mutazioni nella linea germinale è stata applicata per produrre animali geneticamente modificati per diversi studi biologici, tra cui la caratterizzazione della funzione genica e la modellazione delle malattie. Sia gli ovociti che gli spermatozoi sono cellule terminali differenziate e altamente specializzate che hanno cessato la proliferazione. Pertanto, la modifica diretta dei gameti è tecnicamente difficile e sono stati sviluppati approcci specializzati. Le modifiche genetiche possono essere introdotte nella linea germinale del topo mediante iniezione di ESC geneticamente modificati nelle blastocsti, dove si integrano nell'embrione in via di sviluppo e colonizzano la linea germinale. Inoltre, la modificazione genetica degli zigoti utilizzando approcci di editing del genoma, incluso il sistema CRISPR/Cas9, è diventata ampiamenteadottata 2.
Recentemente è stato segnalato un approccio eccezionale, che applica gli haESC come sostituto di un genoma gametico3,4,5,6,7,8. Gli HaESC sono linee cellulari derivate dalla massa cellulare interna delle blastoc aploidi partenogenetiche o androgenetiche e possiedono un singolo insieme di cromosomi4,7,9,10. È stato dimostrato che sia gli haESC partenogenetici che androgenetici possono contribuire al genoma dei topi semi-clonati dopo l'iniezione intracitoplasmatica negli ovociti. A differenza di altri approcci, i genomi degli haESC possono essere modificati direttamente in coltura grazie alla loro capacità di autori ricambio. L'introduzione di modifiche genetiche nella linea germinale sostituendo lo sperma con gli eSCS è un metodo importante per gli studi biologici. Prevede la possibilità di coltura separata e manipolare il genoma materno o paterno, che derivano rispettivamente da haESC partenogenetici o androgenetici. Gli HaESC possono quindi essere usati come sostituzione del genoma gametico, il che è particolarmente vantaggioso per gli studi sull'imprinting genomico, sull'espressione specifica dell'allele e sui processi specifici dei genitori.
Nei topi, sono necessarie informazioni genomiche materne e paterna per il normale sviluppodell'embrione 11. Pertanto, i cuccioli a tempo pieno non hanno potuto essere ottenuti quando gli haESC partenogenetici di tipo selvatico (faESC) sono stati iniettati per sostituire il genoma dello sperma5,8. Per superare il blocco dello sviluppo, l'imprinting genomico del genoma materno degli haESC partenogenetici deve essere corretto in una configurazione paterna. Ciò può essere ottenuto manipolazione delle regioni metilate differenzialmente (DR). Ad oggi, sono state studiate decezioni mirate di H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR e Rasgrf1-DMR per reprimere i geni espressi maternamente nelle fasi3,5,8,12. Questi studi hanno dimostrato che le decezioni sia dell'H19-DMR che dell'IG-DMR sono sufficienti per convertire una materna in una configurazione di impronta paterna che può sostituire i cromosomi spermatici. L'iniezione intracitoplasmatica di faESC che trasportano le due deprezzazioni DMR in ovociti ha prodotto cuccioli semi-clonati con una frequenza compresa tra il 5,1% e il 15,5% degli embrioni a 2 cellule trasferiti.
Questo protocollo si basa sull'applicazione di faESC con soppressioni sia di H19-DMR che di IG-DMR, che noi terminiamo faESC a doppio knockout (DKO-faSEC). Forniamo istruzioni dettagliate per la modifica dell'imprinting genomico nei faESC per stabilire linee DKO-phaESC, per l'iniezione di DKO-faESC negli ovociti come sostituto di un genoma spermatico, per la coltura di embrioni semi-clonati a blastocsti e per ottenere topi semi-clonati. Questo protocollo è un riferimento per i ricercatori che richiedono una manipolazione precisa e diretta del genoma paterno e la generazione di embrioni e topi semi-clonati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mLTube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150628</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M6250</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA fraction</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demecolcine solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D1925</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM / F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DR4 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3208</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E5134</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11897</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated MEF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A34966</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td>
			<td>(Homemade)</td>
			<td>-</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDiff 227</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y40002</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#40973</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac transposase plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>PB210PA-1</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX330 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#42230</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#48138</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F549S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Axon</td>
			<td>A3830</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71729</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Epeendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios EQ</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1640</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge 1/2 inch needle</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z192362-100EA</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6D2F1 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>100006</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG</td>
			<td>MSD animal health</td>
			<td>49451</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Avivasysbio</td>
			<td>OPPA1037 5000 IU</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3260</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital rocker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0878</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M16 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7292</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7167</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1049-1PAK</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>13909</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass cappilary</td>
			<td>Science product</td>
			<td>GB100T-8P</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram 4r Oil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5196000030</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorinert FC-770</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3556</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-U</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlaoder tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252 956.003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulaor arms</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiezoXpert</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5194000016</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PVP360</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

Negli organismi con riproduzione sessuale, le cellule germinali sono la fonte di cellule totipotenti che si sviluppano in nuovi individui. Nei topi, la fecondazione di un ovocita da parte di uno spermatozoo crea uno zigote totipotente. Recentemente, diverse pubblicazioni hanno riferito che le cellule staminali embrionali aploidi (ESES) possono sostituire i genomi gametici e contribuire agli embrioni, che si sviluppano in topi. Qui, presentiamo un protocollo per applicare gli esHC partenogenetici come sostituto dello sperma per costruire embrioni mediante iniezione intracitoplasmatica negli ovociti. Questo protocollo consiste in fasi per preparare gli ESCS come sostituzione dello sperma, per l'iniezione di cromosomi haESC negli ovociti e per la coltura di embrioni semi-clonati. Gli embrioni possono produrre fertili topi semi-clonati dopo il trasferimento dell'embrione. L'uso degli haESC come sostituzione dello sperma facilita l'editing del genoma nella linea germinale, studi sullo sviluppo embrionale e indagini sull'imprinting genomico.

Lo scopo di questo protocollo è quello di applicare i SEBC come sostituti dello sperma per ottenere embrioni e topi semi-clonati. A tal fine, è stata generata e utilizzata una linea DKO-phaESC che trasportava il transgene CAG-EGFP per l'iniezione intracitoplasmatica negli ovociti MII. Per ottenere una linea phaESC adatta con una configurazione di impronta paterna, abbiamo eseguito ingegneria genetica utilizzando nucleasi Cas9. Una linea ESC aploide contiene cellule aploidi e diploidi che sorgono a causa di una tendenza intrinseca degli ESC aploidi per la diploidizzazione10. Un set cromosomico aploide è un prerequisito per una sostituzione riuscita del genoma dello sperma. L'analisi del contenuto di DNA mediante citometria del flusso mostra la distribuzione di cellule aploidi e diploidi nelle fasi G0/G1, S-e G2/M (Figura 2A).
Per stabilire le linee DKO-phaESC, le linee phaESC di tipo selvatico sono state trasfette con costrutti di transposon piggyBac per l'espressione transgenica stabile di EGFP e con plasmidi CRISPR / Cas9 per ottenere eliminazioni degli H19- e IG-DMR. Per escludere gli ESC diploidi e isolare solo gli ESC aploidi che esprimono EGFP, è stato definito un ordinamento specifico (Figura 2A). Le singole cellule aploidi EGFP-positive sono state quindi placcate in singoli pozzi di piastre da 96 pozzi per ottenere sub-cloni. Gli alimentatori MEF sono stati utilizzati per aumentare l'efficienza di placcatura e la sopravvivenza dei FESC trasfetati. Dopo l'espansione delle culture, un primo ciclo di genotipizzazione è stato effettuato da PCR per identificare i sotto-cloni che trasportano eliminazioni di entrambi i D DMR. Dopo che gli alimentatori MEF sono stati rimossi dalle colture, è stato eseguito un secondo genotipizzazione per confermare l'assenza di alleli di tipo selvatico all'H19- e agli IG-DMR (Figura 2B). Su un totale di 135 sotto-cloni, abbiamo ottenuto 5 linee Aploidi DKO-phESC che trasportavano gli alleli cancellati ed erano privi di alleli wildtype sia dell'H19-DMR che dell'IG-DMR.
Un transgene CAG-EGFP è stato introdotto nei DKO-feSC per studiare il loro contributo agli embrioni semi-clonati mediante visualizzazione della fluorescenza verde al microscopio (Figura 3A). Per l'iniezione intracitoplasmatica, i DKO-fasi sono stati trattati con demecolicina per arrestarli in fase M. Pertanto, il ciclo cellulare dei DKO-faESC è stato sincronizzato con quello degli ovociti MII. L'analisi della citometria del flusso ha mostrato 2 popolazioni corrispondenti all'aploide arrestato in fase G2/M (2n) e alle cellule diploidi (4n) dopo il trattamento con demecolcina(figura 3B). L'assenza del picco aploide di 1n indicava che l'arresto del ciclo cellulare era in gran parte completo. Gli ESC aploidi di fase M sono stati quindi ordinati e iniettati in ovociti. Per questo, un singolo DKO-phaESC è stato caricato nella pipetta di microiniezione e iniettato nel citoplasma di un ovocita MII (Figura 3C). La membrana plasmatica del DKO-phaESC è stata interrotta tubazione nella punta della pipetta di microiniezione.
Dopo l'iniezione, l'espressione EGFP è stata raramente rilevata negli embrioni semi-clonati costruiti poiché il citoplasma dei DKO-feSC si era disperso nel grande citoplasma dell'ovocito (Figura 3D). In rari casi, una macchia rotonda di intensa espressione EGFP potrebbe essere osservata all'interno dell'ooplasma. Questa osservazione è stata probabilmente causata dall'iniezione involontaria di DKO-faSC intatti. La mancata rottura della membrana cellulare DKO-phaESC probabilmente non è compatibile con l'ulteriore sviluppo dell'embrione e dovrebbe essere evitata. Un'ora dopo l'iniezione, gli embrioni sono stati attivati mediante trattamento con cloruro distronzio 18. Sei ore dopo l'inizio dell'attivazione, al microscopio sono stati osservati fino a 3 corpi polari(figura 3E). Questi corpi polari corrispondono al primo e al secondo corpo polare dell'ovocita e a uno pseudo corpo polare del DKO-phaESC7. Inoltre, due pronuclei sono stati osservati sotto un microscopio a contrasto di interferenza differenziale, che assomigliava allo stadio pronucleare degli zigoti dopo la normale fecondazione con lo sperma.
Per dimostrare la competenza allo sviluppo, gli embrioni semi-clonati sono stati coltivati allo stadio della blastocista(figura 5A). Inoltre, un topo a tempo pieno è stato ottenuto dopo aver trasferito embrioni semi-clonati a 2 cellule negli ovidotti di una femmina ricevente (Figura 5B). Come previsto, il topo derivato da un embrione semi-clonato era una femmina in quanto né gli ovociti né i faESC derivati dagli ovociti trasportano un cromosoma Y. Il topo semi-clonato era evidentemente normale e produceva prole sana se accoppiato con un maschio webster svizzero di tipo selvatico. Fino ad ora, il topo semi-clonato è vivo da oltre 600 giorni senza apparenti problemi di salute.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Figura 1: Panoramica dell'applicazione dei DKO-fasi come sostituzione degli spermatozoi. (A) Un lasso di tempo delle procedure del protocollo. (B) Lo schema mostra i passaggi per stabilire le linee DKO-phaESC (passaggi da 1 a 6). (C) Lo schema mostra le misure per costruire embrioni semi-clonati mediante iniezione intracitoplasmatica di un DKO-phaESC in un ovocita MII (fasi 7-14). Abbreviazioni: DKO = doppio knockout; phaESC = cellula staminale embrionale aploide partogenetica; FACS = smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza; MEF = fibroblasto embrionale del topo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Figura 2: Definizione di linee DKO-phaESC mediante eliminazioni mediate da CRISPR/Cas9 di DLF H19e IG. (A) Analisi citometrica del flusso dei feSC dopo la trasfezione con plasmidi piggyBac per l'espressione stabile di EGFP e con 4 plasmidi CRISPR/Cas9. Le fasi non trasfette vengono visualizzate come controllo. Il profilo del DNA (in alto) mostra la distribuzione del ciclo cellulare delle cellule aploidi e diploidi. Le cellule aploidi della fase G1/S che esprimono EGFP sono indicate dal cancello verde (in basso, a destra). (B) Genotipizzazione dei sotto cloni phaESC coltivati su MEF (primo genotipizzazione) e dopo la rimozione dei MEF (secondo genotipizzazione). Le righe phaESC sotto-clonate 1, 2, 3 e 4 rappresentano cellule di tipo jolly, celle con eliminazione H19-DMR, con eliminazione IG-DMR e con eliminazioni combinate H19- e IG-DMR, rispettivamente. Le linee DKO-phaESC 5-8 possiedono sia eliminazioni H19-DMR che IG-DMR e sono libere da alleli wildtype. Abbreviazioni: DKO = doppio knockout; phaESC = cellula staminale embrionale aploide partogenetica; DMR = regione metilata differenziale; MEF = fibroblasto embrionale del topo; EGFP = proteina fluorescente verde migliorata; WT = tipo jolly. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Figura 3: Iniezione di DKO-faESC arrestati mitoticamente negli ovociti MII. (A) Morfologia di una coltura DKO-phaESC che trasporta un transgene CAG-EGFP e cancellazioni dei DLF H19 e IG;; barra di scala = 50 μm. (B) L'analisi rappresentativa della citometria del flusso dei DKO-faSES dopo l'arresto con demecolicina per 8 h. DKO-fasi senza trattamento con demecolcina è indicata come controllo. (C) Morfologia dei DKO-faESC nella pipetta di microiniezione. Viene mostrato un singolo DKO-phaESC intatto prima (a sinistra) e dopo (a destra) rupturing della membrana plasma mediante pipettazione; barra di scala = 20 μm. (D) Embrioni costruiti a 1 h dopo l'iniezione di DKO-fasci negli ovociti MII. Viene mostrata un'immagine unita di fluorescenza EGFP e campo luminoso. Le punte di freccia nere indicano punti rotondi di intensa espressione EGFP dopo l'iniezione di DKO-feCS intatti, che dovrebbero essere evitati; barra di scala = 50 μm. (E) Viene mostrata un'immagine di contrasto di interferenza differenziale di embrioni semi-clonati 6 ore dopo l'inizio dell'attivazione con cloruro di stronzio. Le punte di freccia bianche indicano embrioni con 3 corpi polari tra cui uno pseudo corpo polare dal DKO-phaESC iniettato; barra di scala = 50 μm. Abbreviazioni: DKO = doppio knockout; phaESC = cellula staminale embrionale aploide partogenetica; EGFP = proteina fluorescente verde migliorata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Figura 4: Schema dell'installazione per l'iniezione intracitoplasmatica di DKO-fasi in ovociti. (A) Viene mostrata la disposizione di una pipetta di iniezione, di una pipetta di tenuta e di un ovocita nella camera di iniezione. α, angolo di piegatura della pipetta di microiniezione. (B) Disposizione delle gocce nella parabola di micromanipolazione per iniezione intracitoplasmatica. Abbreviazioni: DKO = doppio knockout; phaESC = cellula staminale embrionale aploide partogenetica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Figura 5: Sviluppo di embrioni semi-clonati. (A) Sviluppo preimpianto di embrioni semi-clonati in vitro. L'espressione EGFP è inizialmente osservata negli embrioni a quattro cellule al secondo giorno dopo l'iniezione intracitoplasmatica. Al giorno 4, l'intensa espressione EGFP può essere osservata nelle blastocsti; barra di scala = 100 μm. ( B )Untopo semi-clonato ottenuto dopo il trasferimento di embrioni a 2 cellule a una femmina ricevente. A 74 dpp, il topo semi-clonato (punta di freccia) ha consegnato i suoi primi cuccioli (asterisco) per nascita naturale dopo l'accoppiamento con un maschio webster svizzero di tipo selvatico. Gli embrioni semi-clonati e il topo semi-clonato mostrato in questa figura sono identici a quelli riportati in Aizawa etal. Abbreviazioni: EGFP = proteina fluorescente verde migliorata; .dpp, giorni dopo il parto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Soluzione di gelatina</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Acqua</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>gelatina</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Mezzo aploide a cellule staminali embrionali (HaESC)</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>Lif</td>
			<td>1 x 106 UI/mL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1.000 UI/mL</td>
		</tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Buffer di manutenzione HaESC</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Mezzo HaESC</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Soluzione HEPES</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tampone di lavaggio</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Frazione BSA</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Mef medium</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Fbs</td>
			<td>-</td>
			<td>56 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-mercaptoetanolo</td>
			<td>14,3 mol/L</td>
			<td>3,9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Buffer di Lysis</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Acqua</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>Soluzione SDS</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteinasi K</td>
			<td>20 mg/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Mezzo di attivazione</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Cloruro di stronzio</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,5 M, pH 8,0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Soluzione PVP</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Mezzo M2</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Soluzione PMSG</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 UI/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 UI/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">soluzione hCG</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HCG</td>
			<td>500 UI/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 UI/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Mezzo di ialuronidasi</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Mezzo M2</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>ialuronidasi</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0,5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Abbreviazioni: LIF = fattore inibitorio della leucemia; MEF = fibroblasto embrionale del topo;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = siero bovino fetale; DMEM = Mezzo aquila modificato di Dulbecco; BSA = albumina di siero bovino;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = acido etilendiamminatetraacetico; SDS = dodecilsolfuro di sodio; EGTA = acido tetraacetico etilene-bis(ossienenitrilo);;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = salina tamponata da fosfati; PVP = polivinilpirrolidone; hCG = gonadotropina corionica umana;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = gonadotropina siere della cavalla incinta.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Ricetta di mezzo, tampone e soluzione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>nome</td>
			<td colspan="2">Sequenza (da 5' a 3')</td>
			<td>applicazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Elenco degli oligonucleotidi.

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Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Questo articolo mira a dimostrare l'uso di cellule staminali embrionali aploidi aploidi partenogenetiche come sostituto dello sperma per la costruzione di embrioni semi-clonati.

Applicazione delle cellule staminali embrionali aploidi partinogenetiche del topo come sostituto dello sperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.5K Views.  ETH Zurich. Questo articolo mira a dimostrare l'uso di cellule staminali embrionali aploidi aploidi partenogenetiche come sostituto dello sperma per la costruzione di embrioni semi-clonati.

Video: Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

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Biologia dello sviluppo

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer's role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.

Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Supporto orizzontale intero: un protocollo di elaborazione e imaging novello per le sezioni trasversali tessute spesse e tridimensionali della pelle

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Analisi computazionale della linea germinale Caenorhabditis elegans di studiare la distribuzione dei Nuclei, le proteine ed il citoscheletro

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...