Gli autori riconoscono la Fondazione Leducq (valvola mitrale) e l&#39;Agence Nationale pour la Recherche (ANR concedere Specistem) per il finanziamento di questa ricerca.

1. Preparazione Procedure sugli animali Ottenere l&#39;approvazione di un comitato etico animale e seguire le linee guida istituzionali per il lavoro con il virus, HuESC e / o iPSC (se applicabile), così come la gestione del mouse, l&#39;ottenimento di embrioni di topo, ed eseguire un intervento chirurgico mouse. Per accoppiamenti temporizzati, il giorno della spina è considerato giorno embrionale (E) 0,5 / 0,5 giorni dopo coitum. <ol><li> Aghi microiniezione: Per gli ex utero microiniezione, tirare pipette di vetro (tubi di diametro borosilicato capillari esterni 1,2 millimetri) con un estrattore pipetta / beveller per ottenere un micron di diametro punta interno 1 o 10 e una forma punta acuminata e conica per iniettare il DNA o le celle, rispettivamente. Per le iniezioni ultrasuoni-mediata, l&#39;uso personalizzato aghi sterili, che hanno un diametro esterno / interno (OD / ID) di 1,14 mm/0.53 mm, con una punta di 50/35 micron OD / ID. </li><li> Piatti Silicon-riempite Petri: Preparare silicio come descritto nel manuale. Riempireuna capsula di Petri del diametro di vetro pulito 60 con uno strato di elastomero ~ 1 cm. Evitare bolle d&#39;aria. </li><li> Strumenti: Tenere tutti gli strumenti chirurgici sterili, prima e durante la procedura. </li><li> Preparazione del DNA: Aggiungere 3 g DNA e 12 microlitri Opti-MEM in un tubo. Aggiungere 3 ml Lipofectamine 2000 e 12 microlitri Opti-MEM in un altro tubo. Incubare per 5 min a temperatura ambiente e mescolare entrambe le soluzioni. Utilizzare immediatamente. </li><li> Preparazione cellulare: Preparare una sospensione di 10 6 cellule / ml DMEM (Dulbecco Eagle Medium, alte concentrazioni di glucosio e siero di ratto 50%). 50 microlitri di sospensione cellulare finale è sufficiente per 8-10 embrioni. </li><li> Dye preparazione: Utilizzare il verde fluorescente CDCFDA-SE a 25 mg / ml di DMSO. Preparare 20 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C. Diluire 1:100 / 1:200 in soluzione fisiologica sterile o PBS prima dell&#39;uso. </li><li> Preparazione di virus: Utilizzare uno spot generazione 3 ° PGK-GFP che esprimono lentivirus con un titolo di ~ 10 9 -10 10 TRAnsducing unità / ml DMEM. Per la preparazione dei lentivirus, vedere Tiscornia et al. 14 Indossare indumenti protettivi ed utilizzare in modo sicuro e smaltire virus. </li></ol> 2. Insieme di E9.5 e E10.5 embrioni per Ex vivo iniezione <ol><li> Euthanize un topo gravide al giorno embrionale 9.5 o 10.5. </li><li> Sterilizzare il torace e l&#39;addome del mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Effettuare una incisione mediana ventrale per aprire l&#39;addome e recuperare il corno uterino a temperatura ambiente in PBS e trasferirlo dopo due lavaggi PBS ad un piatto di silicone riempito di Petri con M16 medie. </li><li> Pin il corno uterino con perni insetti allo strato di silicone in modo che il lato vascolarizzata dell&#39;utero è in basso. </li><li> Tagliare la superficie dell&#39;utero con una pinza sottile, e un tappo del decidua a 1 mm sotto la superficie. </li><li> Richiamare delicatamente l&#39;embrione nel sacco vitellino, diffondendo le pareti della decidua. </li><li> Conservare gli embrioni a 37 °; C in M16 mezzo prima iniezione di cellule. Per l&#39;iniezione, ogni embrione viene trasferito al piatto di silicone riempito con M16 medio pre-riscaldato a 37 ° C. </li></ol> 3. DNA o l&#39;iniezione di cellule allo stereomicroscopio <ol><li> Riempire la pipetta di vetro dal retro con una siringa Hamilton e scuotere la pipetta per rimuovere le bolle sulla punta. </li><li> Impostare la pipetta sul supporto microiniezione; impostare la pressione di mantenimento di 50 (DNA) o 30 (celle) hPa, e la pressione di iniezione di 150 (DNA) a 300 (cellule) hPa. Impostare il tempo di iniezione di 0,2 sec (DNA) o 0,5 sec (celle). Queste impostazioni potrebbero variare leggermente a seconda del tipo di microinjector e pipetta. </li><li> Pin l&#39;embrione al fondo silicone attraverso il sacco vitellino senza toccare l&#39;embrione corretta. Guarda la regione del cuore e aprire la sacca appena sopra questa regione. </li><li> Aggiungere 4 pin in tutto l&#39;embrione per evitare qualsiasi movimento durante l&#39;iniezione di cellule. </li><li> Utilizzando il micromanipolatore (impostato su manuale), slowly posizionare la punta della pipetta con un angolo di 45 ° al di sopra del pericardio, appena sopra la regione del cuore che deve essere iniettato (Figura 1). </li><li> Spostare la pipetta nella regione di interesse e attivare l&#39;iniezione. Estrarre la pipetta il più rapidamente possibile. Assicurarsi che il cuore sta battendo correttamente dopo l&#39;iniezione di DNA / cellula. </li></ol> 4. Embryo, isolato Cuore, e Espianto Cultura <ol><li> Coltura gli embrioni E9.5 a 25% M2 medio e siero di ratto 75%, addizionato con penicillina / streptomicina, pre-riscaldato a 37 ° C e ossigenata con 40% O 2. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno di coltura in una provetta di vetro da 25 ml, aggiungere delicatamente l&#39;embrione, e ossigenato con il 40% O 2, prima di avvitare il tappo sul tubo. Incubare fino a 36 ore a 37 ° C durante la rotazione o agitazione (30 giri / min). </li><li> Al punto di tempo desiderato (ad esempio 24 ore), sezionare i cuori accuratamente con una pinza sottile, senza toccare i cuori, per prima decapitating gli embrioni; il cuore è facile da accise estraendolo con il tratto di efflusso distale. </li><li> Cultura cuore isolato per un altro 36-48 ore in DMEM con 50% FCS su un inserto Matrigel rivestite ambientato in un 12-pozzetti. Per un protocollo di miglioramento della cultura del cuore 15 Vedi Dyer e Patterson (2013). </li><li> Fare qualsiasi espianto della regione di interesse. Come esempio, sezionare il canale atrio-ventricolare (AVC) e coltura per 48 ore a collagene di tipo 1 gel 16. </li></ol> 5. Iniezione Ultrasound-guida nel Cuore I n utero <ol><li> Impostazione della macchina ad ultrasuoni e microinjector: <ol><li> Utilizzare il sistema ad ultrasuoni ad alta risoluzione con un trasduttore 40 MHz e la configurazione microiniezione su un binario. </li><li> Impostare il volume di iniezione sul microinjector a 69 nl per iniezione. Consultare il manuale microiniezione del produttore per la programmazione microinjector. </li></ol></li><li> Preparazione del microiinstallazione njection ed iniezione: <ol><li> Posizionare una micropipetta di vetro nel microinjector. Per assicurare un efficiente iniezione, prima mano il lato interno della pipetta con olio minerale aspirando fino al volume massimo. Quindi espellere nuovamente l&#39;olio, lasciando 1-2 mm di olio all&#39;interno dell&#39;ago. </li><li> Aspirare l&#39;iniettato fino a raggiungere il volume massimo. Fare attenzione a non toccare le superfici con la punta dell&#39;ago come questo smussare la punta e rendere più difficile l&#39;iniezione. </li><li> Per stabilizzare il corno uterino contenente gli embrioni durante l&#39;iniezione, utilizzare un piatto Petri modificato con un foro nel mezzo (diametro 2,5 cm), coperto da una membrana di silicone sottile con una piccola fessura tagliata al centro, e posizionarlo sopra il sito di incisione . Stabilizzare il piatto Petri sul tavolo gestione del mouse posizionando 3-4 ciuffi di argilla sotto i bordi del piatto. </li></ol></li><li> Procedura di iniezione: <ol><li> Radere l&#39;addome di un topo in stato di gravidanza (allo stadio embrionale desiderato) prima di anestesiaSia per eliminare i peli. Trattare l&#39;addome con un agente depilazione chimica per rimuovere capelli residuo e sterilizzare con il 70% di etanolo. </li><li> Anestetizzare un mouse incinta con ossigeno / isoflurano tramite una maschera. Utilizzare 3-5% isoflurano in ossigeno al 100% per anestesia, seguita da 1-1,5% durante il resto della procedura. Assicurarsi che il mouse sia adeguatamente anestetizzato da pizzicando delicatamente le zampe e / o coda. </li><li> Posizionare il supina mouse sulla tabella gestione del mouse (impostato per riscaldare a 37 ° C) e coprire gli occhi con lubrificante per prevenire la disidratazione della cornea. </li><li> Applicare il gel per elettrodi sugli elettrodi e nastro le zampe agli elettrodi per monitorare la frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, e l&#39;ECG. Posizionare un termometro rettale per controllare la temperatura corporea. </li><li> Verificare prima che il mouse è incinta visualizzando e contando gli embrioni con l&#39;ecografia. Applicare il gel per ultrasuoni sull&#39;addome e posizionare la testina di scansione sopra la vescica. Per coerenza, visualizzare la vescica prima,e contare embrioni in fianco e corna uterine destra, a partire dalla posizione della vescica. Assicurarsi che i cuori embrionali battono normalmente. </li><li> Se il mouse è incinta, posizionare la capsula di Petri sopra il futuro sito di incisione con l&#39;argilla. Premere il piatto leggermente sul ventre in modo che il piatto è in contatto diretto. </li><li> Rimuovere il piatto e sterilizzare nuovamente l&#39;addome. Fare un 1,5-2 cm linea mediana ventrale incisione, a circa 0,75-1 cm al di sopra della vagina, per aprire l&#39;addome e del peritoneo. Evitare lesioni agli organi interni. </li><li> Esteriorizzare sinistra o corno uterino destra con le pinze, tirare delicatamente attraverso la membrana di silicone del piatto, e stabilizzare nuovamente il piatto in argilla. Prevenire vasta tirare o manipolazione, in quanto ciò potrebbe causare sanguinamento dei vasi uterini e la morte prematura del femminile e / o embrioni. </li><li> Contare di nuovo gli embrioni per garantire un&#39;adeguata tenuta dei registri di cui embrioni sono stati iniettati. </li><li> Applicare il gel per ultrasuoni sulla ucorni terine per l&#39;immagine del cuore e per prevenire la disidratazione. </li><li> Immagine il primo embrione da iniettare. Controllare il normale battito del cuore embrionale e tenere un registro di orientamento cranio-caudale e sinistra-destra dell&#39;embrione. Se necessario, riposizionare il corno uterino leggermente per assicurare il corretto orientamento. Se questo risulta difficile, passare al successivo dell&#39;embrione. </li><li> Perforare l&#39;utero accuratamente con l&#39;ago microiniezione per posizionare l&#39;ago in un angolo di 45 ° sopra l&#39;embrione, leggermente al di fuori del pericardio (Figura 3). Per l&#39;etichettatura di cellule epicardico immagine cuore in quattro camere e posizionare l&#39;ago in modo che punti verso il solco atrio-ventricolare (Figura 3). Se l&#39;angolo deve essere regolato, estrarre l&#39;ago e riposizionare. Non regolare l&#39;angolazione con l&#39;ago all&#39;interno dell&#39;utero, dal momento che questo potrebbe rompere l&#39;ago. Evitare la puntura altri tessuti, come arti o placenta. </li><li> Spostare l&#39;agosulla parete pericardica e forare con un movimento delicato, ma veloce. In generale, ci sarà una certa resistenza, ma spostando l&#39;ago troppo veloce può causare la punta dell&#39;ago per perforare il cuore stesso. La punta dovrebbe finire nello spazio pericardico del solco atrio-ventricolare. In caso di sanguinamento pericardico, globuli saranno visibili come un modello neve come bianco. Se questo è il caso, fermare iniettando l&#39;embrione e passare ad un altro embrione. </li><li> Iniettare l&#39;iniettato. Iniettare al massimo 700 nl nello spazio pericardico per evitare effetti negativi sullo sviluppo cuori. Monitorare l&#39;iniezione corretta da lieve, gonfiore temporale del sacco pericardico. </li><li> Dopo iniezione, estrarre l&#39;ago e confermare che iniettato può ancora essere espulso per assicurare che l&#39;ago non è ostruito da frammenti di tessuto. </li><li> Riposizionare la tabella di gestione per l&#39;immagine e iniettare il prossimo embrione. Mantenere il numero di embrioni iniettati ad un massimo di 3-4 (in un corno uterino) per impedireanestesia esteso, per consentire embrioni di controllo nel corno uterino opposto, e per assicurare che la procedura non disturbare sviluppo embrionale. </li><li> Dopo aver iniettato il numero desiderato di embrioni, rimuovere gel ultrasuoni eccesso e posizionare delicatamente il corno uterino nuovamente dentro l&#39;addome nella posizione corretta. </li><li> Chiudere dell&#39;addome materno, utilizzando uno strato di sutura per peritoneo e muscoli addominali, e un secondo strato di sutura per la pelle. </li><li> Iniettare il mouse con la prima dose di farmaci antidolorifici. Utilizzare una iniezione di 0,05-0,1 mg / kg Buprenorfina 15 minuti prima di terminare anestesia e tre iniezioni supplementari con intervalli di 12 ore. </li><li> Interrompere l&#39;anestesia e monitorare il mouse per un adeguato recupero dalla procedura. Casa il mouse incinta in una gabbia individuale per la durata desiderata di follow-up. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circ. Res. 111, 344-358 (2012).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li><li>Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+the+differentiation+niche+of+embryonic+stem+cells+using+biomaterials.">Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials.</a> Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).</li><li>Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cardiac+development:+a+view+from+stem+cells+to+embryos.">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc. Res. In press, (2012).</li><li>Cai, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myocardial+lineage+derives+from+Tbx18+epicardial+cells.">A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells.</a> Nature. 454, 104-108 (2008).</li><li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken.">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+limb+and+brain+patterning+in+early+mouse+embryos+by+ultrasound-guided+injection+of+Shh-expressing+cells.">Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells.</a> Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase:+the+universal+reagent+for+genome+tailoring.">Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26, 99-109 (2000).</li><li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal.">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal.</a> Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).</li><li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tools+for+the+developmental+biologist:+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development.">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ex+vivo+Culture+Method+for+the+Embryonic+Mouse.">A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse.</a> J. Vix. Exp. , (2013).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I protocolli intra-cardiaca ex vivo di iniezione sopra descritti sono stati concepiti per preservare la funzione miocardica per almeno 48 ore in mid-stage (E9.5-E11.5) embrioni di topo. Questi approcci iniezione consentire l&#39;iniezione spazialmente mirato di DNA o cellule. I pochi esempi riportati nelle figure 1-3 forniscono la prova di concetto per delineare ex vivo e in vivo dei meccanismi molecolari dei processi di sviluppo che si svolgono in regioni ristrette cardiaci, ...

Più di un decennio fa, le cellule staminali embrionali umane (HuESCs) sono state derivate da blastocisti umane 1. Da allora, queste cellule sono diventati oggetto di un importante campo di ricerca che affronta le domande insoddisfatte in biologia dello sviluppo umano. HuESCs hanno inoltre fornito speranze nella medicina rigenerativa. Negli ultimi anni, le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs) sono stati generati da cellule somatiche paziente-specifiche, fornendo modelli di malattia genetica 2. Molti protocolli in vitro per la differenziazione delle cellule staminali embrionali pluripotenti indotte o verso varie linee cellulari, comprese le linee del cuore 3, sono stati segnalati. Le cellule differenziate sono spesso caratterizzati fenotipicamente mediante analisi di RNA e proteina espressione, immunostaining, e / o nei test funzionali in vitro. Tuttavia, i derivati ​​di cellule staminali pluripotenti devono essere collocati in un ambiente embrionale adeguato per verificare se essi acquisiscono pienamente il cell destino della loro controparte embrionale e se ricapitolano la vera funzione in vivo in risposta alle indicazioni regionali. Mentre l&#39;ingegneria dei tessuti è promettente, ma non fornisce ancora tutti i segnali noti e sconosciuti di una corretta in vivo di sviluppo tessuto embrionale 4,5. Etichettatura delle cellule con coloranti o vettori retrovirali in embrioni, compresi embrioni di topo, hanno portato importanti informazioni circa l&#39;origine embrionale delle linee cellulari durante lo sviluppo cardiaco 6. Ad esempio, tingere iniezione nello spazio pericardico di embrioni di topo ex vivo, seguita da coltura in vitro di cuori isolati, è stato utilizzato per marcare cellule epicardici ed i loro discendenti 7. Tuttavia, tintura e l&#39;etichettatura delle cellule retrovirali sono stati per lo più applicate agli embrioni precoci di topo con gli organi ancora poco sviluppate, o embrioni di pollo, che sono più facilmente accessibili 8. Un&#39;eccezione è il cervello, che è più facile bersaglio in embryos 9,10. Tale approccio non è stato ancora applicato al battere del cuore embrionale del mouse. Per completare l&#39;etichettatura diretta con coloranti o virus e di effettuare lineage tracing in embrioni di topo fase più avanzata e topi adulti, l&#39;approccio di etichettatura delle cellule è stato combinato con l&#39;analisi di topi transgenici che utilizzano la tecnologia Cre / Lox. L&#39;approccio Cre / Lox 11 presenta tuttavia alcune limitazioni dovute alla specificità spazio-temporale delle regioni regolatorie genomiche utilizzate per guidare l&#39;espressione della ricombinasi, e l&#39;efficienza della ricombinazione Cre / Lox 12. Inoltre, questo approccio non risolve appieno le domande specifiche della cella migrazione guidata acquisizione del destino delle cellule in quanto si può etichettare solo un precursore dopo l&#39;attivazione della regione regolatoria utilizzato per guidare l&#39;espressione Cre. Inoltre, non può applicarsi agli embrioni umani per ovvie questioni etiche. Date queste limitazioni, abbiamo progettato una serie di nuovi protocols per iniettare una varietà di agenti di etichettatura cella come coloranti fluorescenti, virus, modulatori dell&#39;espressione genica come shRNAs e vettori etichettatura cella basate sul DNA, o cellule nell&#39;embrione mouse sul E9.5 e stadi di sviluppo in regioni oggetto della cuore. Le iniezioni di DNA / cellulari utilizzano uno stereomicroscopio e un semplice dispositivo di microiniezione combinato con ex vivo coltura degli embrioni fino a 48 ore, o di cuore isolato o di cultura espianto embrionale per 48-72 ore. Segnaliamo anche un protocollo microiniezione ecografia-mediata in topo cuori embrionali in utero. Questa tecnica permette di monitorare lo sviluppo degli embrioni 13 e consente a lungo termine di follow-up dei injectates e / o cellule marcate. Abbiamo trovato che questi approcci conservazione della funzione dell&#39;organo e forniscono un ambiente più rappresentativo di test in vitro di cellule staminali potenziale. Esso prevede inoltre la possibilità di seguire la migrazionedi etichettatura e / o iniettato cellule per monitorare il loro destino. In definitiva, questo dovrebbe garantire una migliore comprensione di patterning tessuto regionale e processi biologici chiave.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Setups / Hardware</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:411px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">40 MHz Transducer</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td>MS550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjector</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to pressurize the injector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Rail system</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rotator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>to rotate glass tube with embryos inside the incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Standard incubator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>5% CO2, 37 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">Discovery. V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Vevo 2100</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">borosilicate capillary tubes</td>
			<td style="width:175px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:104px;">KTW-120-6</td>
			<td>1.2 mm external diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pipette puller&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sutter</td>
			<td style="width:104px;">Model P87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">microinjection needles</td>
			<td>Origio-Humagen&#160;</td>
			<td>C060609</td>
			<td>OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Petridishes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Silicon membrane</td>
			<td style="width:175px;">Visualsonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>4.3x4.3 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Play-Doh</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">Vet One</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hair removal agent&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Nair</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:175px;">Optixcare</td>
			<td>31779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode gel (Signa)</td>
			<td style="width:175px;">Parker</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Suture</td>
			<td style="width:175px;">Sofsilk 5-0</td>
			<td style="width:104px;">S1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:175px;">Aquasonic</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td style="width:104px;">NDC 12496-0757-1</td>
			<td>0.05-0.1 mg/kg in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass petridishes</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>60mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Media and culture reagents</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimem medium</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">51985026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Eagle Medium</td>
			<td style="width:175px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">BE12-640F</td>
			<td>high glucose and 50% rat serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M16 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rat serum</td>
			<td style="width:175px;">Janvier</td>
			<td style="width:104px;">ODI 7158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pennicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15140-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">oxygen 40%</td>
			<td style="width:175px;">Air liquid</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to oxygenate the embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:104px;">RVJ35882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">matrigel</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">collagen type I</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">354236</td>
			<td>to coat culture dishes for explant culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">culture dishes</td>
			<td style="width:175px;">Dutcher /Orange</td>
			<td style="width:104px;">131020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Injectates</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDCFDA-SE&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Molecular Probes&#160;</td>
			<td>C1165</td>
			<td>25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGK-GFP-expressing lentivirus&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>~8E9 transducing units/ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell labeling and injection in developing embryonic mouse hearts

Testare il destino di cellule staminali derivati ​​embrionali o pluripotenti nei protocolli in vitro ha portato a risultati controversi che non riflettono necessariamente la loro potenziale vivo. Preferibilmente, queste cellule devono essere collocati in un ambiente embrionale adeguato al fine di acquisire il loro fenotipo definito. Inoltre, linea cellulare tracciando studi nel topo dopo etichettatura cellule con coloranti o vettori retrovirali è rimasto per lo più limitato alle fasi iniziali embrioni di topo con gli organi ancora poco sviluppati. Per superare queste limitazioni, abbiamo progettato i protocolli microiniezione standard e ultrasuoni-mediata per iniettare vari agenti in regioni mirate di cuore in embrioni di topo a E9.5 e fasi successive di sviluppo. Espianto embrionale o gli embrioni vengono poi coltivate o da sinistra a sviluppare ulteriormente in utero. Questi farmaci comprendono coloranti fluorescenti, virus, shRNAs, o cellule staminali progenitrici di cellule di derivazione. I nostri metodi permettono la conservazione del function dell&#39;organo durante il monitoraggio della migrazione e il destino delle cellule marcate e / o iniettati. Queste tecnologie possono essere estesi ad altri organi e sarà molto utile per affrontare le questioni biologiche fondamentali in biologia dello sviluppo.

Utilizzando i protocolli di iniezione sopra descritti, le cellule possono essere etichettati e / o iniettati nel cuore embrionale mouse. Come prova di concetto, alcuni esempi sono riportati in cui il protocollo di iniezione e la ex vivo AVC espianto, isolato cuore, o tutta la cultura embrioni sono stati combinati (Figura 1). La Figura 1 mostra la preparazione dell&#39;embrione prima dell&#39;iniezione delle cellule. L&#39;embrione E9.5 viene estratt...

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Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Descriviamo una serie di metodi per iniettare coloranti, vettori di DNA, virus e cellule per monitorare sia destino cellulare e fenotipo di cellule endogene e innestate derivate da cellule embrionali o pluripotenti entro embrioni di topo al giorno embrionale (E) 9.5 e fasi successive di sviluppo.

Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  Aix-Marseille University.  Descriviamo una serie di metodi per iniettare coloranti, vettori di DNA, virus e cellule per monitorare sia destino cellulare e fenotipo di cellule endogene e innestate derivate da cellule embrionali o pluripotenti entro embrioni di topo al giorno embrionale (E) 9.5 e fasi successive di sviluppo. 

Video: Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Ricerca

Biologia

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

Etichettatura in vitro di cellule staminali embrionali umane per la Risonanza Magnetica

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-orbitale iniezione in Zebrafish adulti

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Unicellulari registrazioni di aspirazione da Fotorecettori Cone mouse

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video Bioinformatica Analisi delle embrionali umane crescita Colony cellule staminali

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un sistema per<em&gt; Ex vivo</emColtura&gt; del pancreas embrionale

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

Separazione dei Ectoderma embrionali di topo viso e Mesenchima

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...