Supporto da NSF (EPS EPSCoR-0814251) e NIH (1P20GM103653-01A1) di MKT e HSD, supporto istituzionale studente di Delaware State University a MDM (titolo III HBGI) e KRS (NIH-INBRE) si ringraziano. Grazie al centro di genetica del c. elegans (supportato da NIH ufficio di ricerca infrastrutture programmi P40 OD010110) per c. elegans ceppo selvaggio-tipo N2.

Protocolli indicati di seguito sono stati standardizzati per testare gli effetti dell'esposizione al BPA durante l'embriogenesi precoce e possono essere modificati per l'utilizzo con BPS, BPF o altri EDCs e sostanze tossiche sugli embrioni di c. elegans .
1. materiale installazione
<ol><li>Preparare 500 mL di media18 Nematode crescita Media (NGM) sciogliendo 1,5 g di NaCl, 1,25 g di peptone e 8,5 g di agar-agar in acqua a 500 mL. Dopo la sterilizzazione in autoclave (121 ° C, 15 PSI, 20 min), aggiungere 0,5 mL di colesterolo (5 mg/mL in etanolo), 0,5 mL di 1 M MgSO4, 0,5 mL di 1 M CaCl2 e 12,5 mL di 1 M tampone fosfato di potassio, pH 7,4 (108,3 g di KH2PO4 35,6 g di K2HPO4, acqua a 1 L).</li>
	<li>Preparare una soluzione di ipoclorito con 25 mL di 1 N KOH, 4 mL di candeggina e 71 mL di acqua. Rendono questa soluzione fresca.</li>
	<li>Preparare il tampone di M9 mescolando 3 g di KH2PO4, 6 g di Na2HPO4, 5 g di NaCl, 5 mL di 1 M di MgSO4e l'acqua per 1 L.</li>
	<li>Preparare S Buffer18 mL 129 di 0,02 M K2HPO4, 871 mL di KH2PO4e 5,85 g di NaCl.</li>
	<li>Sterilizzare in autoclave buffer M9 e S.</li>
	<li>Far crescere una cultura notturna di Escherichia coli (ceppo OP 50) in 20 mL di brodo di Luria (LB).</li>
	<li>Dissolversi BPA in etanolo di 10% per ottenere una soluzione stock di 1 mM. Effettuare diluizioni successive di 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM e 10 µM nel buffer di S. Nota: Diluizione nel buffer S acquoso riduce notevolmente la concentrazione di etanolo; per esempio, a più alta concentrazione di BPA descritto in questo protocollo (10 µM), la concentrazione di etanolo è 0.1% v/v.</li>
</ol>2. c. elegans Culturing e sincronizzazione
<ol><li>Versare i media NGM in piastre di 100 mm (circa 25 mL/piastra) e lasciare solidificare. Una volta solidificato, seminare le piastre distribuendo 150 µ l di e. coli OP50 dalla coltura liquida cresciuta durante la notte. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Il giorno successivo, trasferimento N2 vermi sulle nuove piastre in chunking una lastra approssimativa di 1 cm quadrati. Consentire il worm a crescere per 3 giorni a 20 ° C fino a quando la piastra viene popolata con gli adulti maturi ben nutriti contenenti embrioni visibili.</li>
	<li>Per sincronizzare, lavare ogni piastra pipettando fino a 5 mL di tampone di M9 su tutta la piastra. Trasferire il liquido in una provetta conica sterile 15 mL. Nota: La sincronizzazione avviene per uccidere i vermi adulti e raccogliere gli embrioni che sono relativamente la stessa fase.</li>
	<li>Centrifugare a 3.000 x g per 4 min a temperatura ambiente al fine di ottenere un pellet sciolto di vermi adulti.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta 10ml, rimuovere con cautela il supernatante in modo da lasciare intatto il pellet. Aggiungere 5 mL di soluzione di ipoclorito e mescolare delicatamente.</li>
	<li>Centrifugare a 3.000 x g a temperatura ambiente per 4 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante con una pipetta da 10 mL e lavare con 7 mL di tampone di M9. Ripetere questo passaggio due volte.</li>
</ol>3. esposizione di vermi al BPA
<ol><li>Dopo l'ultimo lavaggio dal passaggio 2.7 sopra, sospendere circa 100 µ l di uova con buffer di M9. Trasferire circa 50 µ l di uova provette microfuge 2 mL già contenente la concentrazione appropriata che BPA diluito in un tampone di S. Regolare la quantità di S-tampone per garantire la corretta concentrazione finale del BPA (0.0 µM, 0,1 µM, 0,5 µM, 1,0 µM, 5,0 µM e 10 µM) per tubo. La tabella 1 illustra un modo per rendere queste diluizioni.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Per la concentrazione finale di BPA</td>
			<td>Stock BPA (100 μM)</td>
			<td>Buffer di S</td>
			<td>Vermi sincronizzato</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 ΜM</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>949 ΜL</td>
			<td>50 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 ΜM</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>945 ΜL</td>
			<td>50 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ΜM</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>940 ΜL</td>
			<td>50 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ΜM.</td>
			<td>50 Μ l</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>50 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ΜM</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>850 ΜL</td>
			<td>50 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Stock BPA, S buffer e sincronizzati vermi usati per raggiungere la desiderata concentrazioni utilizzate per il nostro studio.
<ol start="2"><li>Inserire le provette in un agitatore e agitare delicatamente per 4 h a 20° C, a 25 giri/min per un agitatore rotante o si inclina 25min per un agitatore a dondolo.</li>
	<li>Dopo 4 h, inserire le provette in supporti del tubo e consentire vermi a stabilirsi.</li>
	<li>Eliminare il surnatante e trasferire vermi seminati piastre (NGM con OP50 Escherichia coli). Rendere la coltura liquida OP50 Escherichia coli come indicato in 1.5 e le piastre del seme come indicato al punto 2.1.</li>
	<li>Lasciate che i vermi crescono per 60 h a 20 ° C. Esaminare piastre ogni giorno per contaminazione. Piastre di NGM contaminati sono solitamente scoloriti e accompagnate da diverse colonie. Verifica vermi sotto il microscopio per sovraffollamento. Una mancanza di prato OP50 Escherichia coli e vermi concentrati in piccole macchie significare sovraffollamento.</li>
</ol>4. anteriore Touch assuefazione Assay
<ol><li>Trasferire circa 10 giovani sincronizzati vermi adulti a nuove piastre NGM non teste di serie, utilizzando un filo di platino 30g fuoco-sterilizzato pick. Lasciare riposare per 5 min consentire loro vermi tempo per acclimatarsi alla nuova piastra.</li>
	<li>Per la risposta di assuefazione, utilizzare un capelli sopracciglio fissato all'estremità di uno spiedino di legno o stuzzicadenti e sterilizzare mediante immersione in etanolo al 70%. Pulire con un panno pulito privo di lanugine e attendere 1 min per etanolo ad evaporare. Toccare delicatamente il worm sulla testa (anteriore del bulbo faringeo) utilizzando i capelli del sopracciglio. Ripetere i tocchi, permettendo 10 s tra tocchi al fine di permettere al worm di recuperare.</li>
	<li>Continuare a toccare (permettendo 10 intervalli di interstimulus s) fino a quando il verme non si muove all'indietro. A questo punto, il worm ha abituati allo stimolo. Registrare il numero di tocchi necessari per il verme a habituate.</li>
	<li>Analizzare la differenza tra i tassi medi di assuefazione dei controlli trattati e non trattati mediante One-way ANOVA seguito dal test post-hoc di Tukey.</li>
</ol>5. worm fecondità Assay
<ol><li>Trasferimento individuale L3 worm per un piatto fresco e teste di serie, usando un plettro di platino. Assicurarsi che solo un verme è posto per piastra. Nota: dopo la fase larvale L3, vermi si sviluppano in stadi larvali L4 e nell'età adulta. Presto li picking è conveniente in quanto sono abbastanza grandi per il trasferimento di singoli animali, garantendo nel contempo che non abbiano già posto tutte le uova che altrimenti sarebbero saltate nel conteggio.</li>
	<li>Contare il numero di uova deposte ogni 12-24 h. Dopo il conteggio, è possibile trasferire il worm di padre per una nuova piastra. Ripetere fino a quando il worm smette di deporre le uova, in genere dopo 5 giorni quando incubate a 20 ° C. Nota: in media, un worm di tipo selvaggio può deporre fino a 300 uova; di conseguenza, trasferendo il padre per una nuova piastra ogni giorno impedisce di sovraffollamento.</li>
	<li>Analizzare la differenza tra il numero medio di uova deposte dai controlli trattati e non trattati usando il One-way ANOVA seguito dal test post-hoc di Tukey.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary+to+EDC-2:+The+Endocrine+Society's+Second+Scientific+Statement+on+Endocrine-Disrupting+Chemicals.">Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society's Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals.</a> Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).</li><li>Braun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-life+exposure+to+EDCs:+role+in+childhood+obesity+and+neurodevelopment.">Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).</li><li>Melnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+the+National+Toxicology+Program's+Report+of+the+Endocrine+Disruptors+Low-Dose+Peer+Review.">Summary of the National Toxicology Program's Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review.</a> Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).</li><li>Kortenkamp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+mixing+cocktails:+a+review+of+combination+effects+of+endocrine-disrupting+chemicals.">Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals.</a> Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).</li><li>Vandenberg, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormones+and+endocrine-disrupting+chemicals:+low-dose+effects+and+nonmonotonic+dose+responses.">Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses.</a> Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).</li><li>Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+bisphenol+A+released+from+sealants+and+composites:+a+review+of+the+literature.">Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature.</a> Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).</li><li>Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+Bisphenol+A+Levels+during+Pregnancy+and+Risk+of+Preterm+Birth.">Urinary Bisphenol A Levels during Pregnancy and Risk of Preterm Birth.</a> Environ. Health Perspect. 123, 895-901 (2015).</li><li>Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol-A+and+the+great+divide:+a+review+of+controversies+in+the+field+of+endocrine+disruption.">Bisphenol-A and the great divide: a review of controversies in the field of endocrine disruption.</a> Endocr. Rev. 30, 75-95 (2009).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+neonatal+exposure+to+bisphenol-a+enhances+the+central+dopamine+d1+receptor-mediated+action+in+mice:+enhancement+of+the+methamphetamine-induced+abuse+state.">Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state.</a> Neuroscience. 117, 639-644 (2003).</li><li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+and+phthalate+endocrine+disruption+of+parental+and+social+behaviors.">Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors.</a> Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).</li><li>Patisaul, H. B., Adewale, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+environmental+endocrine+disruptors+on+reproductive+physiology+and+behavior.">Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior.</a> Front. Behav. Neurosci. 3, 10 (2009).</li><li>Lee, D., Jacobs, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+issues+in+human+studies+of+endocrine+disrupting+chemicals.">Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).</li><li>Mimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).</li><li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germline+and+causes+chromosome+abnormalities.">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).</li><li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults.">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain. Funct. 11, 27 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+Germline+Function.">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function.</a> PLoS Genet. 12, e1006223 (2016).</li><li>Rankin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+revisited:+an+updated+and+revised+description+of+the+behavioral+characteristics+of+habituation.">Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).</li><li>Hope, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C elegans: A Practical Approach. , (1999).</li><li>Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+Endocrine+Disrupting+Compounds+on+the+Development+of+Vertebrate+Neural+Network+Function+Using+Multi-electrode+Arrays.">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2017).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook The C. elegans Research Community. , (2007).</li></ol>

Gli autori dichiarano che non hanno nulla da rivelare.

Fasi di rapida crescita e sviluppo come l'embriogenesi sono particolarmente vulnerabili agli effetti nocivi di vari composti endocrino, tra cui il BPA. Forniamo protocolli dettagliati per studiare gli effetti dell'esposizione al BPA o altre sostanze tossiche nel modello invertebrati marini c. elegans , che permette il comodo titolazione di un intervallo di concentrazioni da valutare il suo effetto sulla vitalità dell'embrione (Figura 2) . Follow-up esperimenti comportamentali su come sopravvivere gli adulti che si sviluppano da embrioni che sono stati esposti a basse dosi di BPA consente di diluire gli effetti a lungo termine sulla funzione neuronale (Figura 3). L'idea centrale di questa carta è quello di fornire protocolli dettagliati per l'esposizione di embrioni alle varie sostanze tossiche durante il primo periodo di embriogenesi nel modello elegans del c. ; finestra 4 h prima del suo periodo di sviluppo embrionale 11,5 ore (a 20 ° C) corrisponde al periodo di proliferazione, che è seguito da organogenesi. A tal fine, abbiamo fornito convalida dei punti finali attraverso dosaggi di apprendimento non associativo e fecondità. Mentre la base meccanicistica dell'azione del BPA e altri bisfenoli è il Santo Graal verso cui si rivolge la ricerca in questo campo, abbiamo non tentativo di offrire una spiegazione meccanicistica per l'azione del BPA in questo articolo di concentrati di metodologia. Tuttavia, vorremmo sottolineare che il modello di c. elegans offre un sistema ideale per dividere ulteriormente il meccanismo di azione. Ad esempio, in futuro lavoro su decifrare i meccanismi di azione di BPA, mutanti di c. elegans possono essere generati e schermati per una resistenza agli effetti del BPA e quindi spianano la strada per decifrare la via. Inoltre, la nostra carta di compagno si occupa l'effetto del BPA a livello di sincronia rete neurale nei vertebrati, fornendo un altro viale per comprendere le basi per studiare i meccanismi potenziali per effetti tossico19.
Nella metodologia dettagliata in questa carta, alcuni dei passaggi critici che devono essere eseguiti extra con attenzione sono i seguenti: scegliere un piatto con ben nutrito di c. elegans adulti con uova mature visibili al microscopio di dissezione è cruciale, e non riuscendo a seguire questo passaggio si tradurrà in una dimensione di campione insufficiente degli embrioni per l'esperimento di esposizione EDC. È anche importante assicurarsi che la soluzione di ipoclorito è fatta fresca per evitare di ottenere una popolazione non sincronizzata che interferisca con la capacità di eseguire l'esposizione al BPA durante l'embriogenesi precoce. Lavare il pellet con M9 (dopo l'esposizione di ipoclorito) è anche un passo molto importante. Se non eseguita correttamente, l'alta concentrazione di candeggina potrebbe generare embrioni morti. Inoltre, gli embrioni devono essere trasferiti alle teste di serie NGM piastre dopo 4 h. Se lasciato nella soluzione BPA per un periodo prolungato di tempo, gli embrioni sono possa trasformarsi nelle larve di dauer longevi. Ciò interferirà significativamente sia con analisi di fecondità e analisi comportamentale. Se uno di questi passaggi è mancato, è consigliabile iniziare la procedura dall'inizio. Se per qualsiasi motivo, la piastra NGM con i vermi è contaminata o non hanno cibo a sufficienza, si aggiungerà lo stress sui vermi quindi inclinare i dati raccolti. Tali piastre devono essere eliminati e non essere usati nell'esperimento.
In precedenza, uno studio notevole usato con successo il modello di c. elegans per dimostrare che le anomalie del cromosoma causato dal risultato BPA a causa della rottura del macchinario di riparazione del DNA nel germline14. Tuttavia, è interessante nota che il disegno dello studio sopra aveva usato la continua esposizione al BPA di c. elegans ad alte dosi di BPA in tutta la sua durata. La nostra metodologia è stata progettata per studiare le dosi basse di esposizione al BPA durante l'embriogenesi precoce, in modo dai suoi effetti sulla vitalità embrionale e più sottili effetti a lungo termine i sopravvissuti di analisi. A nostra conoscenza, nessuna metodologia è stata sviluppata per esporre i primi embrioni di fase a dosi molto basse di BPA limitata a un determinato periodo di tempo; così, rendendo il metodo qui presentato il romanzo.
Inoltre, i protocolli forniti qui può essere facilmente adattato per studiare gli effetti di altri EDCs durante la fase di proliferazione dell'embriogenesi. Tuttavia, al fine di studiare la fine delle fasi embrionali, il protocollo richiederà modifiche chiave alla finestra del momento critico dello sviluppo al centro dell'attenzione. Inoltre, il nostro protocollo non sarà adatto per esperimenti che richiedono tempi più lunghi di esposizione tossico, mentre si apre la possibilità del pathway di sviluppo alternativo, conseguente all'arresto di dauer longevi al secondo ciclo muta, che è resistente a dure condizioni20. Saranno necessarie ulteriori modifiche e perfezionamenti per tempi più lunghi di esposizione attraverso integratore con una fonte di cibo che non hanno il potenziale per metabolizzare il tossico o EDC ad esempio in autoclave e. coli. In conclusione, la nostra metodologia può essere utilizzata per valutare gli effetti di varie sostanze chimiche sulla fecondità e sulla funzione di un neurone sistema endocrino nel sistema modello invertebrati elegans del c.

L'esposizione a sostanze tossiche ambientali, in particolare composti quelli che tendono ad interferire con lo sviluppo, è stato sotto attento esame scientifico negli ultimi anni. Più di mille prodotti chimici di uso quotidiano sono classificati come composti (EDC)1il sistema endocrino. Periodi di rapida crescita e sviluppo, che comprendono embrionale, infantile e fasi di infanzia, sono stati notati per essere particolarmente vulnerabili agli effetti deleteri di EDC anche della basso-dose. Loro effetto sono stati indicati per causare disordini riproduttivi e neurodevelopmental2. Secondo la US Environmental Protection Agency e noi National Toxicology Program pannello le linee guida, una dose bassa può definirsi come qualsiasi dose sotto il livello di uno che è stato segnalato per causare un cambiamento biologico osservabile o3. Oltre agli effetti della basso-dose di EDCs individuali, miscele di vari EDCs trovato a basse concentrazioni nell'ambiente hanno il potenziale di causare effetti cumulativi sostanziali4.
Bisphenol A (BPA o 4,4'-(propane-2,2-diyl)) è un agente di polimerizzazione trovato in oggetti comunemente usati come bottiglie d'acqua, archiviazione delle ricevute, sigillanti dentali e i rivestimenti delle bevande e lattine di cibo5. A causa della sua somiglianza strutturale con 17-β estradiolo (E2) e la sua affinità per i recettori degli estrogeni ERα ed ERβ, BPA è stato classificato come un prodotto chimico (EDC)5,6il sistema endocrino. Anche se più debole, affinità di BPA ai recettori degli estrogeni ha dimostrato di influenzare il sistema di riproduzione di entrambi i sessi e interrompere le funzioni neurali a dosi che sono considerate sicuro7,8. Cambiamenti nella metilazione del DNA tramite meccanismi epigeneticamente regolamentati sono stati osservati per causare i difetti di un neurone a lungo termine in topi esposti a BPA9. In particolare, BPA inoltre è stato implicato come un possibile colpevole per tassi aumentati di iperattività, deficit di attenzione e sensibilità aumentata ai farmaci a causa di un aumento visto in ricevitori della dopamina D1 nel proencefalo limbico del mouse dopo esposizione cronica 9 , 10. prova significativa sugli effetti deleteri di EDCs sulla salute umana è basata sugli studi di correlazione concentrandosi principalmente sull'esposizione cronica delle popolazioni a tossici ambientali anche a basse dosi5; Tuttavia, limitazioni a inferenze dagli studi umani e nel manipolare i controlli sperimentali sono state accettate senza tralasciare le critiche infondate hype11,12.
Dovuta alla conservazione dei geni di Caenorhabditis elegans' per quanto riguarda i mammiferi, tra cui suoi geni steroide ormone-recettore, i ricercatori hanno utilizzato questo modello di laboratorio geneticamente trattabili per svelare gli effetti funzionali e meccanicistici di EDCs 13. esperimenti con c. elegans hanno dimostrato che questi composti come BPA e BPS possono causare apoptosi, letalità embrionale, rottura nei meccanismi di riparazione pausa di double-stranded del DNA e la funzione neurale14,15 ,16.
Il nostro laboratorio ha precedentemente dimostrato che anche della basso-dose esposizione limitata a embriogenesi precoce porta a abbassata fecondità con i deficit comportamentali nei superstiti adulti15. Assuefazione ad uno stimolo ripetuto è una forma di apprendimento non associativo in sistemi modello, tra cui c. elegans, e la nostra metodologia utilizza questa forma di apprendimento non associativo come un output comportamentali di saggiare gli effetti a lungo termine dell'esposizione embrionale per le sostanze tossiche17 in particolare, forniamo protocolli dettagliati per studiare l'esposizione al BPA su c. elegans, compresi gli effetti immediati sulla letalità embrionale e gli effetti a lungo termine il comportamento degli adulti, con un complessivo schema raffigurato in Figura 1. Risultati rappresentativi da dosaggi di apprendimento non associativo e fecondità sono forniti per evidenziare l'efficacia della nostra metodologia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25761B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7758-11--4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239658-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>103039-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (Wild-type C. elegans) worms</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire pick</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-2TYY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants

Bisfenoli, come il bisfenolo A (BPA) e bisfenolo S (BPS) sono polimerizzando agenti ampiamente usati nella produzione di materie plastiche e numerosi prodotti di uso quotidiano. Sulla loro struttura chimica e le proprietà biologiche di estradiolo-come base, sono stati classificati come composti (EDC) il sistema endocrino. A lungo termine dell'esposizione a interferenti endocrini, anche a basse dosi, è stato collegato a vari difetti di salute compreso cancro, disturbi comportamentali e sterilità, con una maggiore vulnerabilità indicata durante i periodi dello sviluppo precoce. Studi molecolari e cellulari con il modello geneticamente trattabile del nematode Caenorhabditis elegans hanno dimostrato che l'esposizione al BPA provoca apoptosi, meccanismi di riparazione di letalità embrionale e la rottura del DNA. Precedentemente abbiamo riferito che l'esposizione di embrioni di c. elegans a basse dosi di diversi bisfenoli diminuzioni fecondità. Inoltre, abbiamo dimostrato che gli effetti dell'esposizione durante le primissime fasi di sviluppo persistono nell'età adulta, come analizzato da quantificare il comportamento di assuefazione, una forma di apprendimento non associativo. Qui, forniamo protocolli dettagliati per esposizione embrionale a EDCs della basso-dose così come la fecondità associata e anteriore toccare le analisi di assuefazione, insieme a risultati rappresentativi.

Precedenti studi con c. elegans hanno riferito che la continua esposizione ad alte concentrazioni di BPA (≥ 1 mM) durante lo sviluppo dell'embrione e l'età adulta diminuisce fecondità14. Successivi studi segnalati dal nostro laboratorio hanno mostrato che gli embrioni che sono stati esposti a BPA per un periodo limitato di 4 h nelle fasi iniziali del loro sviluppo hanno mostrato una diminuzione del numero di uova vitali di cui come adulti15 (Figura 2). Due caratteristiche chiave della metodologia sono stati che (i) le concentrazioni di BPA utilizzate erano significativamente più basso (0,1 µM a gamma 10 µM) e (ii) l'esposizione è stata limitata al periodo embrionale precoce. Oltre alla fecondità in diminuzione anche a basse dosi, la nostra assuefazione le analisi hanno rivelato che vermi esposti a BPA come embrioni necessari ulteriori stimoli per diventare abituati rispetto ai vermi esposti al veicolo da solo15 (Figura 3). Questi effetti sono degni di nota in quanto si basano su esposizione al BPA della basso-dose, seguendo la logica che più sottili effetti sulla funzione di un neurone che potrebbe non essere morfologicamente evidente rischiano di essere distinguibile attraverso i cambiamenti del comportamento. In breve, i risultati rappresentativi presentati qui sottolineatura il fatto che gli effetti nocivi dell'esposizione al BPA a un embrione influisce il suo sviluppo, compreso la funzione di un neurone che può essere valutata attraverso analisi comportamentale adulte in c. elegans. I protocolli forniti qui possono essere utilizzati per testare gli effetti della basso-dose, nonché a lungo termine di altre potenziali sostanze tossiche tra cui composti disgregativi endocrini.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg"> Figura 1: rappresentazione schematica del disegno sperimentale. Vermi maturi sono stati raccolti ed esposti a una soluzione di ipoclorito al fine di raccogliere embrioni sincronizzati. Gli embrioni sono stati poi esposti a diverse concentrazioni di BPA per 4 h. Gli embrioni esposti sono stati trasferiti sulle piastre NGM seminati, dove avevano il permesso di crescere per 60 h a 20 ° C. Al fine di testare l'efficacia dell'esposizione durante le prime fasi di sviluppo, i vermi L4 sono stati trasferiti a piatti individuali e testati per la fecondità, e giovani adulti sono stati testati con tocco anteriore assuefazione. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg"> Figura 2: fecondità è abbassato da BPA. L'esposizione a 1 µM e più alte concentrazioni di BPA ha fatto diminuire significativamente il numero di uova deposte rispetto al controllo (rappresentato dalla linea orizzontale; n = 10, *p < 0,05). Le barre di errore indicano SEM. analisi fatta facendo uso di ANOVA, test post-hoc di Tukey. Questa figura è stata modificata da Panda et al., 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg"> Figura 3: effetti a lungo termine dell'esposizione al BPA embrionale si riflettono nel comportamento adulto. Embrioni esposti a BPA concentrazioni basse come 0,1 µM colpisce non associative anteriore tocco assuefazione negli adulti (n = 60, *p < 0,05). Le barre di errore indicano SEM; ANOVA, test post-hoc di Tukey. Questa figura è stata modificata da Panda et al., 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

L'esposizione a sostanze tossiche ambientali possa avere un impatto acutamente sviluppo con effetti a lungo termine. Protocolli dettagliati sono forniti per illustrare una strategia utilizzando un modello di laboratorio efficace per studiare l'effetto di embrionale precoce esposizione al bisfenolo A. Forniamo analisi comportamentale per monitorare l'efficacia della nostra esposizione tossico bio-saggi e fecondità.

Conseguenze a lungo termine del comportamento e riproduttive di embrionale esposizione alle sostanze tossiche della basso-dose

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

long-term-behavioral-reproductive-consequences-embryonic-exposure-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.0K Views.  Johns Hopkins School of Medicine. L'esposizione a sostanze tossiche ambientali possa avere un impatto acutamente sviluppo con effetti a lungo termine. Protocolli dettagliati sono forniti per illustrare una strategia utilizzando un modello di laboratorio efficace per studiare l'effetto di embrionale precoce esposizione al bisfenolo A. Forniamo analisi comportamentale per monitorare l'efficacia della nostra esposizione tossico bio-saggi e fecondità.

Video: Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Cultura e co-coltura di mouse ovaie e follicoli ovarici

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l&#39;esposizione a sostanze chimiche tossiche

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Utilizzando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Trascrittoma Profiling di<em&gt; In-Vivo</em&gt; Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse imaging di Chick primi embrioni

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Una Camera Semplice per l&#39;Imaging Confocale a lungo termine dello sviluppo di radici e ipocotili

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Un metodo In Vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare di Mouse

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...