Questo metodo sarà utile per studi biologici di base relativi all'interazione tra microbiota intestinale e salute intestinale. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di potenziali probiotici e nutraceutici per curare i problemi di salute intestinale, come la sindrome intestinale che perde e le malattie infiammatorie intestinali. Questo protocollo utilizza un sistema di imaging ad alta produttività per consentire un'analisi quantitativa rapida e precisa della permeabilità intestinale nei C.elegans trattati con vari batteri e sostanze chimiche.
Si consiglia a uno scienziato che non ha familiarità con questa tecnica di limita il numero di campioni al fine di evitare errori di etichettatura e altri errori. Questa procedura consiste in molti passaggi che richiedono una dimostrazione visiva, come il trasferimento di worm su piastre da 96 pozzi e l'utilizzo della macchina Operetta, nonché del software Harmony. Inizia preparando 500 millilitri di mezzo LB sterile.
Inoculare una singola colonia di P.aeruginosa nel mezzo e incubare la coltura per 14-15 ore a 37 gradi Celsius mentre si trema a 150 giri/min. Il giorno dopo, distribuire uniformemente la coltura batterica in due tubi da 500 millilitri e centrifugarli a 3, 220 volte g e quattro gradi Celsius per 30 minuti. Rimuovere il supernatante, lasciando 25 millilitri in ogni tubo, per un volume totale rimanente di 50 millilitri, quindi rimescolare il pellet batterico.
Conservare la coltura batterica a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso. Per testare gli effetti dei batteri sulla permeabilità intestinale dei C.elegans, rimuovere le colture dal frigorifero e vortice a fondo. Aggiungere un totale di 800 microlitri a ogni piastra NGM fresca e lasciare asciugare le piastre in un incubatore Celsius di 20 gradi durante la notte.
Per preparare piatti DIM, aggiungere 50 millilitri di mezzo agar NGM in una bottiglia di DIM contenente brodo NGM e mescolare accuratamente. Quindi, versare 20 millilitri del mezzo in ogni piastra di Petri da 90 per 15 millimetri. Preparare le piastre DMSO aggiungendo 20 millilitri di DMSO contenenti mezzo NGM a ogni piastra di Petri e lasciare le piastre a temperatura ambiente per almeno tre ore per solidificarsi.
Stendere 800 microlitri di coltura vortice di E.coli o P.aeruginosa su ogni piastra NGM fresca e lasciare asciugare le piastre in un incubatore Celsius di 20 gradi durante la notte. Lavare le larve L4 sincronizzate con l'età con S-buffer e trasferire circa 500 vermi sulle piastre NGM contenenti diversi batteri e sostanze chimiche. Quindi, incubare le piastre a 20 gradi Celsius per 48 ore.
Preparare le piastre integrate da FITC-dextran mescolando due millilitri di E.coli inattivato dal calore con quattro milligrammi di FITC-dextran. Aggiungere 100 microlitri della miscela a ciascuna delle 20 piastre di agar NGM fresche e lasciare asciugare le piastre per un'ora su un banco da laboratorio pulito. Dopo 48 ore di trattamento, lavare i vermi con S-buffer, trasferirli su piastre integrate in FITC-dextran e su piastre NGM senza FITC-dextran e incubare le piastre durante la notte.
Il giorno dopo, lavare i vermi con S-buffer e consentire loro di strisciare nella piastra di agar NGM fresca per un'ora. Aggiungere 50 microlitri di formaldeide al 4% a ciascun pozzo di una piastra nera a 96 poggia-piatta e trasferire circa 50 vermi in ogni pozzo. Dopo uno o due minuti, rimuovere tutta la formaldeide e aggiungere 100 microlitri di mezzo di montaggio in ogni pozzo.
La formaldeide è una sostanza chimica tossica e deve essere maneggiata con cura. Per acquisire immagini fluorescenti, premere l'icona Apri coperchio all'interno del software di imaging e inserire la piastra nella macchina. Fate clic su Imposta (Setup), selezionate il tipo di piastra e aggiungete i canali brightfield ed EGFP.
Per regolare il layout, passare alla selezione Layout e selezionare Traccia. Impostare la prima immagine a un micrometro, il numero di piani su 10 e la distanza da un micrometro. Selezionare uno dei pozzi di trattamento e un campo di acquisizione e premere Test nella sezione Esegui esperimento.
Se le immagini sono soddisfacenti, tornare alla sezione Setup e premere l'icona Reimposta. Quindi, seleziona tutti i pozzi di destinazione e un numero adatto di campi di acquisizione. Passare a Esegui esperimento, immettere il nome della piastra e premere Start.
Per misurare l'intensità della fluorescenza, passare alla sezione Analisi immagine, inserire l'immagine e trovare la cella scegliendo il canale EGFP e il metodo B.Regolare i parametri in base alle direzioni del manoscritto e scegliere la media come output. Premere l'icona Applica per salvare la configurazione. Ottenere una mappa termica e una tabella dati andando alla sezione Valutazione e regolare il parametro di lettura, quindi avviare la valutazione.
I C.elegans hanno mostrato un aumento significativo della fluorescenza FITC-dextran dopo l'incubazione con P.aeruginosa rispetto agli altri due ceppi batterici, indicando che P.aeruginosa ha causato danni più vitali alla barriera intestinale epiteliale e una maggiore permeabilità intestinale. La P.aeruginosa viva e inattivata dal calore ha innescato effetti molto diversi sulla permeabilità intestinale nei C.elegans. Al momento dell'inattivazione termica, sia le immagini a fluorescenza che i dati statistici indicano che P.aeruginosa non ha innescato alcuna tossicità per i nematodi.
Un co-trattamento di 48 ore con DIM ha diminuito significativamente l'intensità di fluorescenza FITC-dextran all'interno delle viscere dei vermi esposti a P.aeruginosa, il che dimostra che DIM può essere considerato un buon prodotto naturale per curare la disfunzione della permeabilità intestinale causata da infezioni batteriche. È importante ricordare che durante la preparazione delle piastre rivestite in FITC-dextran, è necessario ridurre al minimo l'esposizione alla luce a causa della sensibilità alla luce di FITC-dextran. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare gli effetti patogeni e probiotici dei batteri intestinali e dei loro componenti attivi testando i batteri, così come la loro composizione chimica.
