Questa nuova metodologia ci permette di costruire assemblaggi tridimensionali, adattati dalle singole cellule desiderate, in una soluzione tampone acquosa contenente polimero idrofilo aspecifico, stabilendo un contatto stabile cellulare-cellulare. In questo video, dimostreremo come manipoliamo le singole cellule desiderate e costruiamo assiemi cellulari 3D senza impalcatura artificiale. Qui mostreremo la procedura sperimentale nel nostro mezzo con Dextran come esempio.
Per iniziare, mantenere le cellule epiteliali della ghiandola mammaria del topo NAMRU con cinque millilitri di DMEM, contenenti 10%FBS e 1%Penicillina-Streptomicina, in un pallone di 25 centimetri cubi per due o tre giorni. Quando è pronto per procedere, utilizzare un aspiratore per rimuovere il DMEM integrato e aggiungere da tre a cinque millilitri di PBS, che viene preriscaldato a 37 gradi Celsius per lavare le cellule. Utilizzando un aspiratore, rimuovere tutto il PBS dal pallone.
Aggiungere 1,5 millilitri di tripside che viene preriscaldato a 37 gradi Celsius. Incubare in un incubatore di CO2 a 37 gradi Celsius per almeno uno o due minuti. Successivamente, aggiungere 3,5 millilitri di DMEM contenenti 10%FBS e 1%Penicillina-Streptomicina.
Pipetta su e giù per mescolare. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugarla a 417 volte G per tre minuti a temperatura ambiente. Quindi, aspirare il mezzo.
Aggiungere cinque millimetri di DMEM fresco contenente il 10%FBS e l'1%Penicillina-Streptomicina. E se necessario, utilizzare una soluzione di crioconservazione per crioconservare le cellule come indicato dalle istruzioni del produttore. Prima mescolare 10 millilitri di DMEM integrati con 10%FBS e 1%Penicillina-Streptomicina con 0,8 grammi di Dextran, per preparare una soluzione di Dextran da 80 milligrammi per millilitro.
Mescolare 200 microlitri di questa soluzione di Dextran con 200 microlitri della sospensione cellulare precedentemente preparata, per creare una sospensione cellulare contenente 40 milligrammi per mezzo di Dextran millilitro. Per iniziare, accendi il laser, nota che l'uso di un raggio laser con una lunghezza d'onda nella regione dal rosso al vicino infrarosso è più efficace. Aprire quindi il software facendo doppio clic sull'icona del software.
Fare doppio clic sull'icona della fotocamera e notare che verrà visualizzato il display corrispondente. Quindi fai doppio clic sulle icone per il diodo che emette luce, la regolazione della messa a fuoco e la fase di movimento per aprire anche i loro display. In primo luogo due distanziale in vetro sul vetro di copertura inferiore scivolo.
Trasferire 20 microlitri, il Dextran precedentemente preparato ha integrato la sospensione cellulare sul vetrino del coperchio inferiore. Quindi posizionare lo scivolo di vetro del coperchio superiore sui distanziale che coprono le sospensioni cellulari. Posizionare la cella campione sulla lente obiettivo inferiore con 10 microlitri di acqua distillata per la microscopia ad immersione in acqua.
Attaccare l'obiettivo superiore nella parte superiore della cella campione utilizzando 10 microlitri di acqua distillata. Fare quindi clic sul pulsante di accensione nella finestra di illuminazione del microscopio per accendere il LED. Fare clic sui pulsanti di direzione nella finestra di posizionamento obiettivo per regolare la distanza tra il campione e l'obiettivo inferiore fino a quando non è a fuoco.
Impostare l'intensità di ogni raggio laser su 1500 milliwatt nella finestra di attenuazione del segnale. Quindi, fare clic sulle due icone laser per irradiare i raggi laser in posizione uno e posizionare due. Fare clic sui pulsanti direzionali nella finestra di posizionamento del campione per spostare la fase di campionamento fino a quando una cella non viene intrappolata nella posizione uno.
Fare clic e trascinare il cursore indicando la posizione due fino a quando un'altra cella non viene intrappolata nella posizione due. Per iniziare, manipolare una singola cella, in modo che sia a contatto con un'altra cella. Mantenere questa condizione per 300 secondi, in modo che la cella sia esposta a un laser per 300 secondi.
Registrare l'asse x-y. Intrappolare un'altra cella e trasportarla alle prime due celle per costruire un assieme di celle 2D arbitrario. Quindi spostare lo stage su e giù per costruire un assieme cellulare 3D.
Verificare che l'assieme sia ancora stabile anche dopo lo spegnimento del laser. In questo studio i polimeri solubili vengono utilizzati nella costruzione di assemblaggi a cella singola 3D. Qui viene mostrata una struttura di esempio formata utilizzando le pinzette ottiche a doppio fascio.
Se l'esperimento ha esito positivo, questi gruppi cellulari rimangono stabili anche dopo lo spegnimento del laser. Questa nuova metodologia è per la costruzione di assemblaggi cellulari 3D in un mezzo acquoso con polimero idrofilo naturale. Si prevede vivamente di iniziare la costruzione di questo tipo di assemblaggi cellulari di prossima generazione con alcuni dei potenti strumenti nel campo della medicina rigenerativa e dell'ingegneria tissutale.
