Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biotecnologico e biomedico come quali sono le basi molecolari dietro gli effetti di Warburg e Crabtree. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio ad alta produttività degli effetti di alcune sostanze nel metabolismo respiratorio e fermentativo. Inizia inoculando un tubo conico da 15 millilitri contenente tre millilitri di estratto di peptone destrosio fresco e sterile al 2%, o brodo YPD, con 250 microlitri di cellule di lievito S.cerevisiae conservate nel glicerolo a -20 gradi Celsius.
Incubare il lievito durante la notte in uno shaker orbitale a 30 gradi Celsius e 200 giri/min. per striature su una piastra di Petri piena di agar da 60 millilitri, riempita di agar 2%YPD la mattina successiva. Coltura il piatto a 30 gradi Celsius fino a quando non si osservano colonie isolate.
Quindi inoculare una singola colonia isolata in un nuovo tubo conico contenente 10 millilitri di brodo fresco e sterile 2%YPD per la coltura notturna a 30 gradi Celsius con scuotimento. Per la configurazione della curva di crescita della micropiatta, aggiungere 145 microlitri di un mezzo culturale sperimentale appropriato ad ogni pozzo di una micropiatta sterile da 10 per 10 porcile con coperchio e inoculare ogni pozzo con cinque microlitri della coltura notturna. Quindi incubare la piastra multi-pozzo in un lettore di micropiastrine a 30 gradi Celsius con agitazione costante a 200 giri/min per 48 ore, misurando la densità ottica a 600 nanometri ogni 30 o 60 minuti.
Per l'impostazione della curva di crescita del pallone conico scosso, inoculare 20 matracci conici millilitri contenenti 4,8 millilitri di un apposito supporto di coltura sterile con 200 microlitri di coltura pre-inoculo ad una densità ottica di 600 nanometri di due per l'incubazione a 30 gradi Celsius e 250 giri/min. L'agitazione a 250 giri al minuto è fondamentale per raggiungere una crescita adeguata a basse concentrazioni di fonti di carbonio che esercitano una crescita respiratoria in quanto abbiamo osservato una ridotta crescita del lievito in condizioni respiratorie a velocità di agitazione più basse. Per consentire la misurazione della densità ottica a 600 nanometri ogni due ore per 24 ore, diluire 100 microlitri della coltura di pallone conico scosso in 900 microlitri di acqua distillata in una cuvetta spettrofotometrica da un millilitro e mescolare delicatamente con pipetta.
Per l'elaborazione dei dati, in un software di pacchetti statistici appropriato, creare un nuovo file di progetto, aprire il nuovo menu tabella e grafico e selezionare XY. Nel menu dati di esempio selezionare Inizia con una tabella dati vuota e un grafico a linee di collegamento e punti. Lasciare la sezione X deselezionata nelle sottocolonne per le repliche o i valori di errore. Nella sezione Y, selezionare immettere 10 valori di replica nelle sottocolonne affiancate e tracciare la media e l'errore SD. Quindi fare clic su crea.
Immettere il momento in cui le misurazioni OD sono state ottenute nella colonna X e i valori OD ottenuti dalle impostazioni cultura nella colonna Y. Per identificare la fase di crescita esponenziale che trasforma i dati della colonna Y in logaritmi, fare clic su analizza e selezionare l'analisi della trasformazione. Usa Y uguale al registro Y per selezionare i valori Y e aprire la raccolta dei risultati.
Selezionare la tabella dei dati di trasformazione, fare clic su analizza e selezionare l'analisi di regressione lineare, escludendo i valori di densità ottica che non seguono una tendenza lineare selezionando i valori nella tabella e il controllo deprimente e E.In nella raccolta tabelle dati selezionare i dati di una tabella e fare clic su analizza. Selezionare l'analisi dell'adattamento della curva di regressione non lineare e i set di dati da analizzare e fare clic su OK. Quindi applicare i quadrati meno adatti ai dati, lasciando la sezione interpolata deselezionata e fare clic su OK. Aprire quindi un nuovo file di progetto e nel nuovo menu tabella e grafico selezionare la scelta della colonna, iniziare con una tabella dati vuota e il grafico desiderato. Impostate il grafico per tracciare la media con la deviazione standard e fate clic su Crea (Create).
Copiare i valori del tempo medio o delta dalla tabella dei risultati di adattamento non lineare nella raccolta dei risultati e incollarli in una colonna. Infine, fate clic su analizza (Analyze) e selezionate l'analisi di interesse nel menu di analisi delle colonne per confrontare i parametri cinetici delle diverse condizioni nutrimentali. I valori soglia cinetici di crescita variano tra i punti di forza e devono essere valutati in base alle condizioni che utilizziamo nell'analisi.
Le culture che dimostrano un fenotipo fermentativo hanno una piccola fase di ritardo e una fase esponenziale con un alto tasso di crescita. Le colture che ottengono energia principalmente dalla fosforilazione ossidativa mostrano una fase di ritardo più lunga con un lento tasso di crescita durante la fase esponenziale. Il calcolo del tasso di crescita specifico e il tempo di raddoppio delle curve di crescita utilizzando l'equazione di crescita esponenziale consentono di impostare soglie per i valori di crescita respiratoria e fermentativa.
Ad esempio, in questi esperimenti rappresentativi, gli effetti delle diverse concentrazioni di resveratrolo sulle cellule S.cerevisiae BY4742 rivelano la modifica dello stato energetico cellulare in risposta alle diverse concentrazioni di glucosio. Qui, l'integrazione con glucosio al 10% dimostra che concentrazioni più basse di ammonio favoriscono il metabolismo fermentativo come evidenziato da una fase di crescita esponenziale estesa in queste colture, mentre una maggiore concentrazione induce un metabolismo respiro-fermentativo come evidenziato da una fase di ritardo prolungato e da un tasso di crescita più lento durante la fase esponenziale. Infine, si possono osservare solide differenze nei valori di raddoppio fermentativo tra questi due diversi ceppi di lievito coltivati nelle stesse condizioni, evidenziando la necessità di convalidare la soglia di raddoppio del tempo per ogni ceppo analizzato.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che questo protocollo viene utilizzato solo per schermare il fenotipo. Gli effetti specifici sulla respirazione e sulla fermentazione devono essere confermati rispettivamente dai saggi di consumo di ossigeno o dall'accumulo di sottoprodotti della fermentazione.
