Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della micro-emorragia cerebrale come l'eziologia, la distribuzione e il rilevamento della micro-emorragia cerebrale e così via. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le iniezioni di LPS inducono stabilmente infiammazione. Inoltre, l'iniezione LPS è abbastanza semplice, economica ed economica.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'induzione dell'emorragia cerebrale, può anche essere applicato ad altri disturbi cerebrali come depressione, schizofrenia, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer e malattia dei prioni. Somministrare LPS a una dose di un milligrammo per chilogrammo di peso corporeo ai ratti maschi Sprague Dawley di 10 settimane per iniezione intraperitoneale, quindi riportare ogni topo nella gabbia di casa. Ripetere l'iniezione LPS dopo sei ore e 16 ore.
Si prega di notare che l'iniezione di ratti SD con LPS a una dose di un milligrammo per chilogrammo può comportare una mortalità del 5%. La mortalità potrebbe aumentare ulteriormente nei ratti più giovani o più anziani o nei ratti femmine in gravidanza. Riportare i ratti nelle loro gabbie dopo l'iniezione di LPS e fornire accesso ad libitum a cibi e bevande.
In anestesia terminale, eseguire una puntura cardiaca profonda da cinque a otto millimetri su ogni ratto. Il punto di puntura dovrebbe essere di cinque millimetri al margine sinistro dello sterno nel terzo e quarto spazio intercostale. Tenere l'ago in posizione e sostituire il tubo vuoto con un tubo contenente blu Evans.
Attendere fino a quando non si osserva il recupero del sangue, quindi iniettare Evans blu a una dose di 0,2 millilitri per 100 grammi di peso corporeo nel ventricolo cardiaco sinistro. Mantenere il topo in posizione supina per 10 minuti se si valuta la perdita blu di Evans attraverso la barriera ematica / encefalica mediante imaging di immunofluorescenza. Eseguire perfusioni cardiache utilizzando gelido da 200 a 300 millilitri di soluzione salina allo 0,9% per cancellare la vascucolatura cerebrale e il cervello.
Passare alla paraformaldeide ghiacciata al 4% per la fissazione. Quindi, dopo aver isolato il cervello, immergerlo nel 20% di saccarosio in PBS per almeno sei ore o fino a quando il cervello non affonda sul fondo del tubo. Modificare la soluzione in 30% di saccarosio e fissarla per altre sei ore.
Infine, preparare sezioni di tessuto cerebrale spesse 10 millimetri usando un criostato. Lavare gli scivoli con PBS tre volte per cinque minuti ciascuno, quindi incubare diapositive con soluzione 4, 6'diamidino-2-fenilindolo o DAPI per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le diapositive in PBS come prima, montare le diapositive con soluzione pbs-glicerolo.
Cattura le immagini su un microscopio a fluorescenza. La deposizione EB è indicata dalla fluorescenza rossa, i nuclei sono indicati dalla fluorescenza blu. Inizia la colorazione H&E lavando gli scivoli in acqua distillata.
Quindi immergersi in soluzione di ematossilina per otto minuti. In alternativa, per la colorazione blu prussiana Perl, macchia in soluzione di reazione con miscela di parti uguali di ferrocianuro e acido cloridrico per 10 minuti. Dopo la colorazione, lavare in acqua corrente del rubinetto per cinque minuti.
Differenziare in 1% alcol acido per 30 secondi. Dopo aver lavato in acqua corrente del rubinetto per un minuto, macchiare in acqua di ammoniaca allo 0,2% o soluzione di carbonato di litio saturo per 30 secondi a un minuto. Quindi, lavare in acqua corrente del rubinetto per cinque minuti.
Contro-macchia con soluzione di eosina per 30 secondi a un minuto. Disidratare attraverso il 90% di alcol, quindi il 95% di alcol e alcol assoluto per 0,5-due minuti ciascuno. Dopo la disidratazione, cancellare in xilene per 30 secondi.
Dopo il montaggio, analizzare la colorazione H&E utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo luminoso. I globuli rossi rilasciati dai vasi sanguigni, che sono componenti delle CMH, appaiono in rosso-arancio sotto la colorazione H&E. Le CMH superficiali possono essere rilevate mediante osservazione lorda come indicato dalle frecce rosse.
La colorazione blu di Evans rivela una visibile fluorescenza rossa in cui le molecole blu di Evans sono fuoriuscite da una barriera eencefalica ferita. La colorazione H&E mostra i globuli rossi trovati al di fuori dei capillari e la colorazione prussiana rivela punti di ioni ferrici derivati dalla lisi dei globuli rossi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la dose di LPS per indurre micro-emorragia cerebrale è più grande di quella utilizzata nel morbo di Parkinson o nel modello di schizofrenia.
Pertanto, l'ambiente degli animali dovrebbe essere mantenuto pulito per ridurre il tasso di mortalità. Seguendo questa procedura, altri metodi come la microscopia elettronica, la risonanza magnetica e l'imaging immunofluorescente potrebbero essere eseguiti per determinare il danno alla struttura esterna della barriera ematico-encefalica nella micro-emorragia cerebrale, la distribuzione di micro-emorragie cerebrali nel parenchima cerebrale in vivo, così come l'attivazione delle cellule gliali.
