Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia molecolare e nelle sfere genetiche degli imenotteri, come i sistemi di determinazione del sesso. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo facilmente indurre linee di incrocio sulla formica Vollenhovia Emery, che sono essenziali per la mappatura genetica e lo stato molecolare. Quindi, questa missione può fornire informazioni sul sistema di determinazione del sesso di una formica specifica e può anche essere applicata ad altre formiche e altre specie di imenotteri, come le vespe.
Per iniziare il protocollo, raccogli le colonie di V.Emeryi durante l'inizio dell'estate. Trasferire i campioni di formiche dai rami raccolti a un nido di gesso artificiale con una copertura di vetro, utilizzando un aspiratore. Mantenere le colonie nel nido artificiale a 25 gradi C, sotto un ciclo chiaro-scuro di 16-otto ore.
Fornire acqua del rubinetto con una bottiglia di lavaggio per mantenere l'intonaco umido a giorni e giorni allo stesso tempo. Successivamente, aggiungi circa 100 microgrammi di polvere di grillo secca avvolta in un foglio di alluminio e una punta piena d'acqua di zucchero di canna alla colonia, usando una punta di 20 microlitri a giorni dall'altra giornata fino all'emergere di nuove formiche riproduttive. È importante raccogliere micro colonie dai campi e fornire loro abbastanza cibo per guadagnare nuove regine e maschi.
In primo luogo, impedire agli individui di muoversi posizionando colonie in una stanza con un ambiente controllato impostato a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Rimuovere le gambe medie di 30 formiche operaie utilizzando le forcep sotto uno stereoscopio per distinguere la generazione F-zero dai lavoratori prodotti nelle successive croci di consanguinei. Quindi trasferire le formiche in un nuovo nido di gesso più piccolo per incroci di consanguinei.
Successivamente, aggiungere da tre a quattro larve o pube in un nido di gesso contenente lavoratori. Trasferisci una lunga regina alata e un maschio in un nido di gesso precedentemente preparato per incrociare. Per questo passaggio, è importante mantenere la colonia sperimentale di attraversamento allo stesso stato di quella di una colonia normale.
È difficile indurre l'incrocio semplicemente mettendo insieme maschi e femmine. Mantieni le colonie a 25 gradi Celsius sotto un ciclo leggero e buio da 16 a otto ore con cibo e acqua forniti fino a quando la regina perde le ali e depone le uova. Controlla la colonia sperimentale ogni giorno al microscopio stereo.
Dopo aver istituito le croci di consanguinei tra la prole F-one, le uova possono essere osservate sotto uno stereoscopio. Dopo che la regina F-one inizia a deporre le uova, rimuovere i maschi f-one e le larve o la pube dal nido per impedire alla generazione F-one e alla generazione F-due di mescolarsi. Mantieni le colonie nelle stesse condizioni fino all'emergere della prole F-two.
Rimuovere una gamba di una regina F-zero usando le forcep. Trasferire la gamba in un microtubo da 1,5 millilitri contenente 100 microlitri di un agente freddo. Sotto uno stereoscopio sezionare un addome femminile in un piatto di vetro pieno di 300 microlitri di acqua ultra pura usando le forcep.
Dissimili dagli spermatica contenenti lo sperma dei maschi accoppiati. Staccare il tessuto della spermatica e isolare lo sperma dal tessuto della femmina usando spille per insetti. Utilizzando un micro pastiglia, trasferire lo sperma in un microtubo da 1,5 millilitri contenente 100 microlitri di un agente freddo.
Incubare i campioni dalla regina F-zero e dallo sperma a 95 gradi Celsius per 20 minuti. Flash centro fonde il microtubo e conserva i campioni a quattro gradi Celsius. Dopo aver confermato la produzione di uova da parte della regina F-one accoppiata a siv, estrarre il DNA della regina usando le ali del capannone o una gamba media e genotipo.
Quindi, estrarre il DNA di un maschio F-one genotipando una gamba. Per valutare la fertilità delle formiche maschili dalle croci di consanguinei, sezionare gli organi riproduttivi interni in un piatto di vetro con 400 microlitri di soluzione PBS usando le forcep. Quindi rimuovere il PBS e sostituirlo con una paraformaldiide al quattro% utilizzando un micro pastigliere.
Fissare il tessuto incubando i campioni in PFA per quaranta minuti a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, lavare i tessuti cinque volte con 400 microlitri di PBS utilizzando un micro pastigliere. Diluire la soluzione DAPI a un milligrammo per millilitro in PBS.
Rimuovere il PBS e aggiungere circa 300 microlitri della soluzione di colorazione DAPI diluita al tessuto. Incubare il tessuto per 15 minuti in condizioni di buio a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare il tessuto cinque volte con 400 microlitri di PBS e trasferire il tessuto al centro di uno scivolo di vetro usando le forcelle.
Quindi montare il tessuto su un mezzo di montaggio contenente tetrametillrhodamina TRITC. Infine osservare i campioni con un microscopio a scansione laser confocale utilizzando le lenti obiettivo 20 o 60 3x. Immagini microscopiche di teste di Maschio aploide v Emeryi mostrano tessuto fibroso sano o spermatozoo che sono assenti in Diploid maschio v Emeryi, che non mostravano tessuto fibroso sano.
Gli organi riproduttivi maschili di Diploid maschio v Emeryi non producevano spermatozoi e i loro teste non si sviluppavano, suggerendo che i maschi prodotti nelle croci di consanguinei sono sterili. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ci ha spianato la strada per esplorare la miatoia sessuale in una costante a Vollenhovia Emeryi per le specie di formica a tempi rapidi.
