Questo mistero può aiutare a rispondere ad alcune domande nel campo della biologia cellulare come l'input proteico nei cloroplasti. Il vantaggio principale di questa tecnologia è che l'apporto proteico nei cloroplasti può essere studiato in condizioni en vivo. A dimostrare la procedura saranno Junho Lee e Hyangju Kang, due post out dal mio laboratorio.
Per iniziare, raccogli tessuti fogliari intatti da piante vecchie di due settimane da uno a due piatti B5. Utilizzare un coltello chirurgico per raccogliere le foglie e posizionarle in un tubo conico da 50 millilitri contenente 25 millilitri di soluzione enzimatica. Posizionare il tubo orizzontalmente su uno shaker rotante e incubare con delicata agitazione a 22 gradi Celsius al buio per otto-12 ore fino a quando nella soluzione rimangono solo piioli e steli.
Dopo aver completato l'incubazione, filtrare la soluzione enzimatica contenente protoplasti rilasciati attraverso una rete di dimensioni dei pori da 140 micrometri in una piastra di Petri fresca. Quindi stratalizza con cura la soluzione sopra 15 millilitri di soluzione di saccarosio al 21% in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il tubo in un rotore a benna oscillante a 98 g per 10 minuti con le impostazioni di accelerazione e decelerazione più basse.
Successivamente, utilizzare la pipetta di patura per rimuovere accuratamente i protoplasti dallo strato superiore contenente soluzione enzimatica e dall'interfaccia tra la soluzione di enzimi e la soluzione di saccarosio. Trasferire questa soluzione in un tubo conico da 50 millilitri contenente 30 millilitri di soluzione W5 e invertire il tubo per mescolare. Centrifugare il tubo a 51 g per sei minuti.
Utilizzare una pipetta per scartare attentamente questo supernatante senza disturbare i protoplasti nel pellet. Aggiungere 25 millilitri di soluzione W5 e sospendere delicatamente i protoplasti. Per la stabilizzazione, incubare in un frigorifero di quattro Celsius per un minimo di un'ora.
Dopo quattro gradi Celsius di incubazione, pellet i protoplasti completamente centrifugandoli a 46 g per due minuti. Rimuovere con cura il supernatore completamente e aggiungere la soluzione MANG al pellet di protoplasto per ottenere cinque volte dieci a sei per millilitro. Utilizzare una pipetta per aggiungere 10 microgrammi del DNA plasmatico e 300 microlitri di soluzione di protoplasto a un tubo dal fondo rotondo fresco da 13 millilitri.
Mescolare ruotando delicatamente i tubi a mano e quindi aggiungere immediatamente 300 microlitri di soluzione 40%PEG preparata al momento. Mescolare completamente inclinando il tubo quasi orizzontalmente e ruotandolo dolcemente più volte a mano. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Quindi aggiungere un millilitro di soluzione W5 e mescolare completamente ruotando delicatamente il tubo a mano come in precedenza. Incubare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente. Ripetere altre due volte aggiungendo prima 1,5 millilitri e poi due millilitri di W5 e dopo l'aggiunta finale e la miscelazione, incubare per 30 minuti.
Centrifugare il tubo a 46 g per quattro minuti e quindi scartare il supernatante. Aggiungere due millilitri di soluzione W5 al pellet e mescolare delicatamente, ma completamente, allo stesso modo di prima. Incubare a 22 gradi Celsius in una camera scura per 18 ore.
Per analizzare l'importazione di proteine utilizzando la microscopia a florescence, utilizzare una pipetta con una punta tagliata per posizionare 10 microlitri della soluzione di protoplasto su uno scivolo di vetro. Utilizzare una lapsus per coprire attentamente la soluzione per evitare di danneggiare i protoplasti. Posizionare lo scivolo sul palco di un microscopio a fluorescenza con un filtro di ammissione all'eccitazione impostato per osservare la proteina fluorescente verde e l'autofluorescenza della clorofilla.
Utilizza una fotocamera del dispositivo di coppia di carica raffreddata per acquisire immagini ed elaborarle utilizzando un software di editing immaginato per produrre immagini pseudocolori. Per l'estrazione totale di proteine e l'immunoblotting, rimuovere un millilitro dalla soluzione di protoplasto e mescolare il restante millilitro. Trasferire questa soluzione di protoplasto in un tubo di centrifuga e centrifugare a 46 g per quattro minuti.
Rimuovere il supernatante dopo aver completato la centrifugazione e aggiungere 80 microlitri di tampone di denaturazione. Vortice con vigore per cinque secondi. Aggiungere cinque tamponi campione XDS, mescolare bene e far bollire per 10 minuti alla denaturazione.
Procedere con la pagina STS standard e l'immunoblotting con anticorpo anti-GFP. RbcS e TGFT, un costrutto di fusione che codifica per i 79 residui terminali di amminoacidi terminali di RBCS contenenti il peptide di transito fuso alla GFP, è stato utilizzato per studiare l'importazione di proteine nei cloroplasti mediante microscopia a florescence e immunoblotting. Se esaminati dalla microscopia a florescence, i segnali fluorescenti verdi della proteina bersaglio si sono fusi con i segnali fluorescenti rossi dell'autoflorescenza della clorofilla che indicano l'importazione di proteine nei cloroplasti.
Dopo aver isolato la proteina totale, due bande proteiche sono osservate nell'immunoblot, dimostrando che una proteina è stata correttamente importata nei cloroplasti. La banda superiore corrisponde al precursore di tutta la lunghezza e alla banda inferiore alla forma lavorata dopo l'importazione in cloroplasti. La quantità della forma trasformata della proteina è aumentata in modo dipendente dal tempo, suggerendo che la proteina viene importata in cloroplasti.
In questo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare il stancante proteico o la raccolta del filo di membrana in Arabidopsis.
