Le specie reattive dell'ossigeno o ROS, sono specie di ossigeno altamente reattive prodotte dalle cellule e influenzano il loro comportamento. Sebbene l'eccesso di ROS possa anche causare un diffuso caos cellulare e, nei casi più gravi, la morte cellulare. Pertanto, il mantenimento dell'omeostasi del ROS è di fondamentale importanza per la funzione cellulare e la sopravvivenza.
Il protocollo qui presentato, si concentra sulla misurazione di un tipo specifico di ROS, che è generato dai mitocondri, principalmente come prodotto metabolico nelle popolazioni di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche vive, normali o sane, nonché nelle cellule leucemie del modello di topo del cancro del sangue, leucemia mieloide acuta o AML. Questo protocollo può anche essere utilizzato per valutare come la manipolazione genetica, come la delezione genica o la sovraespressione, abbia un impatto sul ROS mitocondriale in diverse popolazioni ematopoietiche sane e maligne. E di conseguenza, potenzialmente fornire informazioni perspicaci sullo stato redux e possibilmente sul metabolismo delle cellule.
Questa tecnica autorizza l'analisi metrica del sistema di flusso di una sonda protogenica per monitorare la produzione di ROS mitocondriale in fusto ematopoietico vivo sano e maligno e sottopopolazione progenitrice. Questo protocollo è semplice e può essere completato in poche ore. Inoltre, è adatto per l'analisi delle cellule vive e consente di distinguere e analizzare il ROS mitocondriale nella popolazione di cellule staminali nel midollo osseo, utilizzando il segno superficiale di colorazione.
Dopo aver raccolto cellule di midollo osseo mononucleare da topi stretti selvatici e topi leucemici MLL-AF9, secondo il manoscritto, aliquota 200 microlitri della sospensione cellulare in ciascuno dei nove singoli tubi di controllo del colore. Aliquote le celle rimanenti in altri tubi sperimentali, 200 microlitri ciascuno. Quindi mettere in una centrifuga due tubi sperimentali contenenti rispettivamente cellule di midollo osseo e cellule leucemiche e un tubo di controllo.
Centrifuga a 300 volte G per cinque minuti. Successivamente, decantare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in F-PBS a temperatura ambiente con una macchia di cellule vive / morte, secondo le istruzioni del produttore. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti.
Successivamente, aggiungere 1 millilitro di F-PBS a temperatura ambiente ai tre tubi macchiati vivi / morti e un singolo tubo di controllo del colore per la colorazione del colorante ROS mitocondriale. Posizionare i tubi nella centrifuga a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, ottenere una soluzione di colorante ROS mitocondriale da 5 millimolare sospendendo 50 microgrammi di colorante ROS mitocondriale in 13 microlitri di DMSO.
Quindi aggiungere 13 millilitri di F-PBS a temperatura ambiente al colorante ROS mitocondriale da 13 microlitri per diluire a una concentrazione finale di cinque micromolari. Se necessario, aggiungere 13 microlitri di Verapamil da 50 millimolari alla soluzione per inibire le pompe efflux mitocondriali. Ottenere i tubi dalla centrifuga e aspirare dal lavaggio della macchia di cellule vive / morte.
Aggiungere 200 microlitri di F-PBS nel controllo della colorazione vivo/morto e tenerlo nel ghiaccio fino a quando non è pronto per iniziare l'analisi. Aggiungere 200 microlitri della macchia colorante ROS mitocondriale contenente Verapamil, ad ogni tubo sperimentale, così come il tubo di controllo della colorazione ROS mitocondriale. Vortice da mescolare e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius al buio.
Quindi aggiungere 1 millilitro di F-PBS a temperatura ambiente ai tubi di controllo e sperimentali. Centrifugare cinque minuti a 300 volte G a temperatura ambiente. Aspirare il supernato e lavare le cellule con un millilitro aggiuntivo di F-PBS a temperatura ambiente.
Centrifugare di nuovo per cinque minuti a 300 volte G, a temperatura ambiente. In primo luogo, preparare due cocktail anticorpali per cellule del midollo osseo sane e leucemie. Aspirare il supernatante dal tubo sperimentale contenente cellule sane del midollo osseo e aggiungere al tubo 200 microlitri del cocktail anticorpale numero uno.
Vortice da mescolare. Preparare anche i singoli tubi di controllo del colore aggiungendo 200 microlitri di F-PBS e un microlitro dell'anticorpo corrispondente. Incubare per 60 minuti sul ghiaccio al buio.
Aspirare il supernatante dal tubo sperimentale contenente midollo osseo di leucemia e aggiungere 200 microlitri del cocktail anticorpale numero due, al tubo. Vortice da mescolare. Incubare per 60 minuti sul ghiaccio al buio.
Successivamente, lavare tutti i tubi con 1 millilitro di F-PBS freddo e centrifugare per cinque minuti a 300 volte G a temperatura ambiente. Sospendere di nuovo le celle in 500 microlitri di F-PBS freddo. Trasferire la sospensione cellulare in ogni tubo citometrico di flusso con un filtro da 40 micrometri per escludere gli aggregati.
In primo luogo, inserire un tubo di controllo senza macchie nella macchina citometrica di flusso e avviare l'acquisizione per compensare la macchina citometrica a flusso. Ripetere per altri tubi di controllo. Successivamente, leggi i tubi sperimentali per allevare i cancelli.
Per analizzare le dimensioni e la complessità della popolazione cellulare, prima per hspc sano, impostare l'area di dispersione in avanti e l'area di dispersione laterale traccia le popolazioni. Premere il pulsante Porta quadrata, per rimuovere i detriti estranei dal grafico a dispersione anteriore e laterale. Quindi, su un'area di dispersione in avanti e un grafico di altezza, usa un doppio discriminatore per cancello i farsetto.
Selezionare le celle vive, le cellule basse di lignaggio e i vari HSPC integri. Per ogni popolazione di interesse, analizzare l'intensità di fluorescenza mediana del canale TRPE in un grafico istagramma, per valutare le differenze nel segnale ROS mitocondriale. Ripetere la stessa procedura di analisi delle dimensioni, gating e tracciazione dell'istogramma per le popolazioni di leucemia.
Le cellule del midollo osseo isolate da topi sani sono state macchiate con un colorante vivo /morto e un colorante ROS mitocondriale, e successivamente macchiate di anticorpi che riconoscono marcatori di lignaggio:più CD48, C-kit, Sca-1, CD34 e CD150. Inoltre, anche le cellule del midollo osseo dei topi leucemia sono state macchiate con CD45.2 per discriminare tra le cellule di leucemia MLL-AF9 da cellule sane del midollo osseo ricevente macchiate con CD45.1. Un confronto della colorazione ROS mitocondriale, tra LSK negativo CD48 sano e progenitori mieloidi, mostra che i progenitori mieloidi mostrano livelli significativamente più alti di colorazione ROS mitocondriale.
Inoltre, i progenitori ad alta leucemia c-Kit mostrano livelli significativamente più elevati di colorazione ROS mitocondriale, rispetto alle cellule intermedie a bassa leucemia c-Kit, all'LSK negativo CD48 sano e ai progenitori mieloidi. Le cellule intermedie a bassa leucemia del C-Kit, mostrava anche un valore significativamente più alto rispetto alle cellule LSK negative CD48, ma non ai progenitori mieloidi. I coloranti ROS mitocondriali sono altamente reattivi e sono necessarie misure di lavaggio appropriate per garantire che qualsiasi eccesso di colorante sia stato rimosso prima di iniziare i seguenti passaggi.
Ci sono diversi coloranti fluorogenici ROS chimicamente distinti che possono essere utilizzati in questo protocollo, per ottenere un po 'di conoscenza dello stato redux nelle cellule ematopoietiche vive. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata in letteratura, e può fornire utili intuizioni sulle vie metaboliche e di segnalazione che sono regolate in modo differenziato nelle cellule di leucemia, se confrontate con le loro controparti normali.
