Questo metodo può aiutare a comprendere le domande chiave nel campo della migrazione delle cellule immunitarie, come come il citoscheletro invia forze di taglio e come i ligandi integrini e le chemiochine influenzano la migrazione indotta dal flusso dei leucociti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un nuovo tipo di test di migrazione che è facile da eseguire per i principianti. Utilizza solo attrezzature e reagenti disponibili in commercio, nonché software libero.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle cellule di zona marginale B, può anche essere applicato ad altre cellule immunitarie, come le cellule T attivate. Il giorno prima dell'esperimento, scongelare un'aliquota di ICAM-1 e diluirla in PBS ad una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro. Quindi, aggiungere 30 microlitri di ICAM-1 alle camere desiderate di uno scivolo di flusso.
Posizionare lo scivolo in una camera umida e impostarlo a quattro gradi Celsius per incubare durante la notte. Il giorno dopo, lavare la camera aggiungendo 100 microlitri di PBS a un pozzo e quindi prelevando 100 microlitri dall'altro pozzo della camera. Quindi, aggiungere 100 microlitri di tampone di blocco a una camera e incubare lo scivolo in una camera umida a temperatura ambiente per 90 minuti.
Successivamente, lavare la camera aggiungendo 100 microlitri di PBS a un pozzo, ritirarlo dall'altro pozzo, quindi aggiungere 100 microlitri di buffer di migrazione alla camera. La diapositiva è ora pronta per l'uso. Conservarlo in una camera umida a temperatura ambiente fino all'esperimento.
In primo luogo, collegare una pompa del fluido e collegare l'unità fluidica. Quindi, accendere il software della pompa. Quindi, lavare i tubi una volta con da cinque a 10 millilitri di buffer di migrazione.
Ci sarà circa un minuto. Quindi, aggiungere 11,7 millilitri di buffer di migrazione equamente a entrambi i serbatoi e rimuovere le bolle d'aria. Ora, blocca il tubo a circa 10 centimetri dal pezzo del connettore e posiziona l'unità fluidica nella camera di incubazione riscaldata al microscopio.
Nel software, impostare la scelta della diapositiva su micro-slide VI 0.4 e l'opzione tubi su bianco. Inoltre, impostare la sollecitazione di taglio desiderata su circa quattro dynes per centimetro quadrato e il tempo di imaging su 30 minuti. Quindi, impostare la portata desiderata e la sollecitazione di taglio inserendo i valori nel software della pompa.
Successivamente, prerifiscere la camera di incubazione del microscopio, l'unità fluidica e le aliquote del buffer di migrazione a 37 gradi Celsius. Una volta caldo, testare la pompa fluidica, assicurando che il buffer di migrazione fluisca avanti e indietro nei serbatoi e che non ci siano bolle d'aria nel sistema. In primo luogo, isolare i leucociti e purificare le celle marginali della zona B come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento.
Quindi, pulire il fondo dello scivolo con un tessuto inumidito dall'etanolo. Aggiungere 30 microlitri della sospensione cellulare in un pozzo della camera e prelevare 30 microlitri del buffer di migrazione immagazzinato dall'altro pozzo. Coprire lo scivolo e incubarlo per 30 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi.
Successivamente, aggiungere lentamente il buffer di migrazione pre-riscaldato a ogni pozzo della diapositiva fino a quando un menisco positivo esce dal pozzo. Rimuovere eventuali bolle d'aria con la punta della pipetta. È importante mantenere la coerenza con i fattori che influenzano l'adesione della cella, quindi mantenere i buffer e le celle a 37 gradi ed evitare di usare una forza eccessiva quando si pipetta il buffer nella camera.
Bloccare lo scivolo allo stadio del microscopio e rimuovere il lato non contrassegnato del tubo fluido dal pezzo del connettore. Quindi, riempire l'estremità del tubo con tampone di migrazione fino a quando un menisco positivo senza bolle d'aria sale fuori dalla fine. Capovolgere l'estremità del tubo e inserirlo nel pozzo superiore della camera di flusso.
Pur mantenendo il tubo bloccato, ripetere la procedura per l'estremità contrassegnata del tubo. A questo punto, passare al sistema di imaging in modalità Live e selezionare un campo visivo che si trova al centro della diapositiva. Qui, impostare lo stato attivo sulle celle, quindi de-focalizzare leggermente per migliorare il contorno nero delle celle e produrre un interno bianco.
Lo sfondo nero e il centro bianco saranno più facili da usare nel programma di tracciamento automatico. Impostare il programma di sequenza di imaging per registrare un'immagine ogni cinque secondi per 30 minuti utilizzando un obiettivo a secco 10x. Quindi, inizia a registrare.
Rimuovere il morsetto dal tubo e accendere la pompa. Ciò farà sì che le cellule non aderenti si lavano e le cellule aderenti inizino a migrare. Alla fine del programma di imaging, etichettare e salvare il film.
Se si utilizza un inibitore o un modificatore di migrazione cellulare, può essere aggiunto alle celle nella sospensione cellulare prima di metterle nella diapositiva o nel buffer di migrazione nell'unità fluidica. Per iniziare l'analisi automatica della traccia di migrazione, aprire il programma ImageJ. Copiare MTrack2_kt file Java nella cartella ImageJ Plugins.
Nel menu Plugin selezionare Compila ed esegui. Quindi, riavviare ImageJ e il plug-in dovrebbe apparire nel menu Plugins. Apri lo stack di immagini dal filmato di migrazione delle celle in ImageJ ed elabora le immagini come mostrato qui per convertire il video da cornici a colori a immagini a contrasto elevato che mostrano le celle come oggetti neri su uno sfondo bianco.
Successivamente, affilare le immagini due volte, despeckle le immagini e quindi convertire le immagini in otto bit. Nel menu Immagine passare al sottomenu Regola luminosità/contrasto e mettere il dispositivo di scorrimento Contrasto al massimo contrasto. In questo modo le celle appariranno come oggetti bianchi su uno sfondo nero.
Tornare quindi al sottomenu Regola soglia per assicurarsi che le celle vengano visualizzate come oggetti neri su uno sfondo bianco. Ora, esegui il plug-in automatico di tracciamento delle celle MTrack2 kt. Nella schermata delle opzioni impostare la dimensione minima delle particelle su un pixel e la dimensione massima delle particelle su 30 pixel.
Impostate il valore di velocità su 10 pixel, anche se le celle marginali della zona B in genere non supereranno i due pixel su fotogrammi successivi distanti cinque secondi. Le tracce cellulari sono ora pronte per l'analisi utilizzando lo strumento ibidi Chemotaxis. Questi due campi mostrano i percorsi di migrazione delle celle marginali di zona B che sono state sementi su diapositive rivestite con ICAM-1.
Le celle sono state tracciate automaticamente con MTrack2 utilizzando i metodi descritti in questo articolo. A sinistra, le celle erano immagini in condizioni statiche, e sulle celle giuste erano esposte a un flusso di taglio di quattro dynes per centimetro quadrato. Le singole tracce di cella possono essere importate nello strumento ibidi Chemotaxis per generare tracciati di ogni filmato.
Qui, le singole tracce cellulari sono colorate di rosso per indicare che sono finite a valle del loro punto di origine o nere se sono finite a monte. L'analisi delle tracce cellulari di quattro singoli filmati sia per il flusso che per nessuna condizione di flusso viene mostrata qui. Ciò include l'indice medio di migrazione direzionale, la velocità cellulare, la rettilineità del percorso e la distanza finale della linea retta per entrambe le condizioni.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come immaginere la migrazione direzionale delle celle di zona marginale B verso il flusso di taglio e come tenere traccia automaticamente delle celle. Durante questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microscopia TIRF per rispondere a domande aggiuntive, ad esempio come il citoscheletro e le integrine rispondono allo stress da taglio?
