Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione ospite-patogeno come la patogenicità e la virulenza dell'infezione batterica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che possiamo valutare la tossicità tra e all'interno delle specie Aeromonas e contribuire alla nostra comprensione della patogenesi dell'infezione da Aeromonas. Per iniziare a lavare circa 2.000 vermi adulti gravidi con acqua deionizzata sterile.
Ripetere il lavaggio tre volte mantenendo i vermi nella parte inferiore del tubo. Dopo aver centrifugato i vermi rimuovere il supernatante e mantenere i vermi in 3,5 millilitri di acqua deionizzata. Aggiungere un millilitro di ipoclorito di sodio e 0,5 millilitri di idrossido di potassio al tubo.
Quindi agitare il tubo per sei minuti per liscire i corpi del verme. Dopo che le uova sono state rilasciate, aggiungere 10 millilitri di acqua deionizzata per fermare lalisi. Quindi centrifugare il tubo per tirare giù le uova e rimuovere il più possibile il supernatante.
Lavare le uova con 15 millilitri di mezzo M9 almeno tre volte. Trasferire le uova in un piatto di 3,5 centimetri e incubarle a 20 gradi Celsius per una notte. Dopo questo rimuovere 10 microlitri di vermi L1 e mezzo M9 dalla piastra.
Contare i vermi e ottenere la concentrazione di vermi L1 nel mezzo M9. Utilizzando una pipetta prendere 0,5 millilitri di brodo E.coli OP50 LB e stenderlo su una piastra ENGM. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 16-18 ore.
Raffreddare l'ENGM a temperatura ambiente. Quindi semi incubato vermi L1 su una piastra ENGM con E.coli OP50. Incubare i vermi a 20 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio L4.
In primo luogo, selezionare una singola colonia di ciascuno dei quattro ceppi aeromonas e culturarli secondo il protocollo di testo. Quindi misurare l'assorbanza OD 600 del brodo batterico e regolarlo fino a quando l'assorbanza è uguale a 2,0. Punto successivo e stendere 30 microlitri di brodo batterico da ogni ceppo in piastre NGM.
Selezionare e trasferire casualmente i vermi L4 precedentemente preparati sulle piastre NGM con i ceppi di Aeromonas. Quindi incubare le piastre a 20 gradi Celsius fino al completamento del test. Ogni giorno trasferisci tutti i vermi viventi in una nuova piastra NGM con batteri.
Conta il numero di vermi viventi, morti e sensori ogni giorno fino a quando l'ultimo verme non è morto. Dopo aver coltivato i ceppi di Aeromonas e misurato la loro assorbanza come descritto in precedenza, centrifugare il brodo batterico a 3.500 g per 15 minuti. Regolare il brodo batterico con S Medium.
E aggiungere 195 microlitri di brodo batterico nel mezzo S a otto pozzi di una piastra da 96 porri. Lavare i vermi dalla piastra ENGM con loro mezzo M9. Quindi regolare la concentrazione della soluzione worm su cinque vermi per microlitro.
Aggiungere cinque microlitri della soluzione di verme a ciascuno dei pozzi della piastra da 96 porri. Incubare il piatto su uno shaker e contare il numero di vermi vivi a 24, 48 e 72 ore. Dopo aver coltivato i ceppi di Aeromonas e regolato l'assorbanza in base al protocollo di testo, individuare e diffondere il brodo batterico sulle piastre NGM.
Successivamente, trasferire 50 vermi L4 su ogni piastra NGM. Ogni 24 ore trasferire i vermi su piastre NGM fresche. Selezionare casualmente 10 vermi e trasferirli in un gel di agarosio al 2% in mezzo M9 su una diapositiva.
Infine posiziona un coverslip sul gel e cattura le immagini muscolari con un filtro proteico fluorescente verde su un microscopio fluorescente dotato di una fotocamera. In questo protocollo sono state valutate le tossicità di quattro ceppi di Aeromonas. Il tasso di sopravvivenza dei C.elegans infettati dalle specie di Aeromonas era più alto nei saggi che usava le A.caviae, e il più basso nei saggi usando A.dhakensis.
In un saggio di tossicità liquida la sopravvivenza dei C.elegans è diminuita significativamente se infettata da A.dhakensis o A.hydrophilia. Nel test di necrosi muscolare i gradi di danno muscolare variavano tra le specie di Aeromonas. A.caviae ha causato il minor danno muscolare, mentre A.dhakensis ha prodotto il maggior danno muscolare.
I metodi descritti in questo video offrono un modo conveniente per differenziare la diversità di virulenza tra e all'interno delle specie Aeromonas. Inoltre, è anche un modello affidabile con cui studiare l'interazione tra un agente patogeno e un ospite.
