Tomografia seriale a due fotoni dell'intero cervello dell'uistitì per analisi neuroanatomiche

La nostra ricerca esplora le basi strutturali delle funzioni cerebrali, comprese quelle negli esseri umani. Utilizzando l'uistitì comune come modello, miriamo a comprendere meglio il cervello dei primati identificando le connessioni neurali che sono condivise tra le specie e quelle che sono unicamente al di fuori del genere dei primati. Abbiamo eseguito una mappatura completa delle proiezioni prefrontali del cervello dell'uistitì.

Utilizzando la tecnica della tomografia seriale a due fotoni, siamo riusciti a ricostruire in 3D in modo estremamente accurato l'intero cervello, che ha rivelato robuste proiezioni colonnari tra le aree di associazione. La tomografia seriale a due fotoni fornisce un set di dati per comprendere la connettività neurale su tutta la scala cerebrale. Il nostro protocollo non solo aiuta a migliorare l'elaborazione del cervello degli uistitì, ma offre anche informazioni sulla gestione di altri campioni.

Per iniziare, prendi il cervello isolato e fisso dell'uistitì e incubalo con collagenasi a 37 gradi Celsius per un'ora. Usando un batuffolo di cotone, strofina accuratamente la superficie del cervello per staccare la pia madre e altre meningi. Utilizzare una pinza fine per rimuovere eventuali meningi staccate rimanenti.

Per preparare il tampone boroidruro di sodio, sciogliere 0,2 grammi di boroidruro di sodio in 100 millilitri di tampone borato da 50 millimoli, preriscaldato a 40 gradi Celsius. Preparare l'agarosio ossidato mescolando 2,25 grammi di agarosio e 0,21 grammi di periodato di sodio in 100 millilitri di tampone fosfato per due o tre ore. Filtrare la soluzione utilizzando l'aspirazione sottovuoto e lavarla con tre cambi di tampone fosfato.

Quindi, risospendere l'agarosio in 50 millilitri di tampone fosfato. Quindi, sciogliere completamente l'agarosio in un forno a microonde e lasciarlo raffreddare a 60-65 gradi Celsius. Posiziona il cervello in una camera su misura e incorpora il cervello nell'agarosio, assicurandoti che l'agarosio riempia la cavità sotto il corpo calloso.

Dopo la solidificazione del gel di agarosio, smontare la camera e immergere il blocco di agarosio nel tampone boroidruro di sodio per una notte a quattro gradi Celsius. Ora, utilizzando una miscela istantanea epossidica, costruisci un tavolino in vetro per vetrini attaccando quattro magneti al neodimio. Montare il blocco di agarosio sul tavolino utilizzando un adesivo forte.

Utilizzare l'intero sistema di imaging tissutale seguendo le istruzioni del produttore. Elabora l'intero cervello dell'uistitì coronalmente dalle estremità anteriori a quelle posteriori. Quindi, regolare gli angoli delle pale per assicurarsi che le profondità della superficie su entrambe le estremità siano entro 10 micrometri.

Per fare ciò, cerca la superficie superiore cambiando la posizione dell'obiettivo, utilizzando il controller piezoelettrico. Impostare il piano di imaging a una distanza compresa tra 25 e 35 micrometri dalla superficie per compensare la mielinizzazione densa e garantire una penetrazione laser uniforme. Usando una lama di ceramica, tagliare l'intero cervello a intervalli di 50 micrometri, ottenendo circa 650 fette.