Questo protocollo è significativo per determinare la funzione glicolitica e la respirazione mitocondriale in Candida albicans. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di misurare la funzione mitocondriale senza la necessità di purificare i mitocondri dagli albicani di Candida. Questo metodo può essere ottimizzato per indagare gli effetti della manipolazione genetica o dei modulatori chimici sulle vie mitocondriali e glicolitiche negli albicani Candida o in altri agenti patogeni fungini.
Questa tecnica è relativamente semplice. O a seconda dell'organismo, il loro uso può aiutare a ottimizzare il numero di cellule e la concentrazione di inibitori mitocondriali nel loro saggio. In una cappa di flusso laminare, sciogliere la poli-D-lisina nell'acqua della griglia tissutale fino a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro.
Mescolare bene la soluzione e aliquotarla in tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri assicurandosi di aliquota di almeno 1,3 millilitri per tubo. Aggiungere 50 microlitri di questa miscela a ciascun pozzo della piastra di dosaggio, coprire il coperchio e incubare a temperatura ambiente per una o due ore. Quindi aspirare la soluzione.
Risciacquare i pozzi della piastra di dosaggio una volta con 500 microlitri di acqua sterile di coltura tissutale, aprire il coperchio e lasciare asciugare all'aria i pozzi. Se non si utilizza il piatto il giorno in cui viene preparato, conservarlo a quattro gradi Celsius per un massimo di due o tre giorni. Il giorno prima dell'esperimento, aprire il kit di dosaggio del flusso extra e rimuovere il contenuto.
Posizionare la cartuccia del sensore capovolta accanto alla piastra di utilità. Riempire ogni pozzo della piastra di utilità con un millilitro di calibrant e quindi riposizionare la cartuccia del sensore. Assicurarsi che i sensori che contengono fluorofori siano immersi nel calibante.
Incubare la cartuccia del sensore a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica durante la notte. Il giorno prima del saggio, inoculare gli albicani C preparati nel brodo YPD e crescere durante la notte a 30 gradi Celsius in uno shaker a 200 giri/min. Il giorno del saggio, diluire un numero appropriato di cellule nel mezzo di dosaggio per produrre una concentrazione finale di 100.000 cellule per 100 microlitri.
Aggiungere 100 microlitri delle cellule diluite in ogni pozzo della piastra di dosaggio ad eccezione dei pozzi A1, B4, C3 e D6. A questi pozzi, aggiungere solo 100 microlitri di mezzo di dosaggio per la correzione dello sfondo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica per 60 minuti per lasciare che le cellule aderiscano alla superficie della piastra. Preparare i composti per il saggio della funzione mitocondriale a concentrazione 10X nel mezzo di dosaggio corrispondente come delineato nel protocollo di testo.
Aggiungere 50 microlitri di SHAM nella porta A, 50 microlitri di Oligomicina nella porta B, 62 microlitri di cianuro di potassio nella porta C e 68 microlitri di antimicina A nella porta D.Successivamente, preparare i composti per il saggio di stress glicolitico a concentrazione 10X nel mezzo di dosaggio corrispondente come delineato nel protocollo di testo. Aggiungere 50 microlitri di glucosio alla porta A, 55 microlitri di Oligomicina nella porta B, 62 microlitri di 2-DG nella porta C e 68 microlitri di Antimicina A nella porta D.Prima del test, aprire l'analizzatore di flusso aggiuntivo e impostare il modello di saggio utilizzando la scheda della procedura guidata di dosaggio. Seguire le istruzioni dettagliate e compilare tutte le informazioni visualizzate durante l'installazione.
Generare un layout di gruppo e impostare il protocollo come descritto nel protocollo di testo. Salvare questi layout prima del test. Al momento del test, ripristinare il protocollo salvato aprendo il file corrispondente nell'opzione open file nella scheda creazione guidata test.
Quindi caricare i composti 10X nelle rispettive porte della cartuccia del sensore idratata contenente il calibrant. Caricare la cartuccia del sensore nel vassoio portante dell'analizzatore di flusso aggiuntivo. Avviare la calibrazione facendo clic sul pulsante start sullo schermo.
Successivamente, aggiungere delicatamente 350 microlitri del mezzo di dosaggio alla piastra cellulare lungo il lato delle pareti per ridurre al minimo il disturbo cellulare portando il volume finale a 450 microlitri. Sostituire la piastra di utilità contenente il calibrant con la piastra di dosaggio e continuare il saggio. Una volta completato il test, rimuovere la cartuccia del sensore e la piastra.
Salvare il file nella cartella di destinazione appropriata. In questo studio, le funzioni bio-energetiche degli albicani C sono valutate dall'analizzatore di flusso extra. Un mutante privo della proteina mitocondriale mam33 è anche incluso insieme al suo ceppo complementare per studiare gli effetti della cancellazione di una proteina mitocondriale sul tasso di consumo di ossigeno e sui tassi di acidificazione extracellulare.
Il tipo selvatico C albicans mostra un tasso di consumo di ossigeno di 145 picomoli al minuto che è ben all'interno dell'intervallo ottimale per qualsiasi saggio di flusso extracellulare. Il tasso di consumo basale di ossigeno del tipo selvatico, i ceppi mutanti mam33 e mam33 non mostrano differenze. Allo stesso modo, non si vedono differenze significative nei tassi di acidificazione extracellulare basale tra i ceppi.
Tuttavia, inibendo il complesso IV con cianuro di potassio, il tipo selvatico e il mutante mam33, i ceppi integrati mam33 mostrano uno spostamento significativo verso la glicolisi. Il ceppo mutante mam33 tuttavia non ha mostrato uno spostamento glicolitico compensativo che suggerisse che la via dipendente dal composto IV è compromessa in questo ceppo. Nella prova di stress glicolitico, le cellule sono affamate di glucosio per un'ora e viene misurato il tasso di consumo basale di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare.
Dopo la fame, il ceppo mutante mam33 mostra un consumo significativamente inferiore di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare rispetto agli altri ceppi. Ciò suggerisce un uso alterato del glucosio sia per la respirazione che per la glicolisi quando le cellule sono costrette alla condizione di fame. Dopo aver iniettato glucosio, tutti i ceppi mostrano stimolazione sia del loro tasso di consumo di ossigeno che del tasso di acidificazione extracellulare.
Il rivestimento della piastra di dosaggio consente alle cellule di Candida albicans di aderire alla piastra. L'aderenza impropria delle cellule di Candida albicans influenzerà il risultato del test. Dopo lo sviluppo di questa tecnica, è stato impiegato in una vasta gamma di tipi cellulari e malattie affrontando come funzionano i mitocondri durante le condizioni fisiologiche e patologiche.
Ad esempio, impiegando cellule derivate dal paziente e di controllo in questo saggio, è possibile affrontare le domande specifiche su come la funzione mitocondriale viene alterata. Prestare attenzione durante la preparazione di inibitori mitocondriali come cianuro di potassio e antimicina A perché questi composti sono estremamente velenosi.
