Questo studio indaga su come l'abuso cronico di alcol influisca sulla funzione immunitaria dei macrofagi alveolari alterando il metabolismo mitocondriale. Nel complesso, la nostra ricerca evidenzia l'intersezione tra uso di alcol, metabolismo e funzione immunitaria, rendendola rilevante per campi come l'immunologia, la farmacologia e la salute pubblica. Sebbene l'uso di alcol abbia effetti dannosi noti, i meccanismi metabolici specifici e in particolare il ruolo dell'ossidazione della glutammina nei macrofagi alveolari non sono completamente compresi.
Inoltre, questo protocollo colma una lacuna metodologica che ne consente la riproducibilità in studi futuri. Questo protocollo consente di effettuare misurazioni sensibili in tempo reale della respirazione mitocondriale di più repliche tecniche e biologiche. Può essere regolato per altri tipi di cellule ed è più affidabile per il test della funzione metabolica rispetto ad altre tecniche che richiedono più tempo o campioni di dimensioni maggiori.
Questi risultati chiariscono l'impatto dell'esposizione all'etanolo sul metabolismo della glutammina dei macrofagi alveolari, che potrebbe influenzare gli interventi terapeutici in studi futuri. In generale, ci aspettiamo di vedere uno spostamento verso la comprensione del metabolismo cellulare della glutammina e di altri modelli di malattia. Il nostro lavoro si è concentrato sulla comprensione di come i macrofagi polmonari metabolizzano le fonti di carburante per produrre energia.
Poiché i macrofagi hanno bisogno di molta energia per le funzioni immunitarie, come la segnalazione ad altre cellule immunitarie e la fagocitosi e l'eliminazione dei patogeni, i nostri prossimi passi si concentreranno sul collegamento dei cambiamenti nel metabolismo energetico con la funzione immunitaria dei macrofagi. Per iniziare, prelevare cellule MHS in coltura trattate con etanolo per 72 ore e coltivate fino ad almeno il 50% di confluenza in fiasche T75. Crea una mappa delle piastre con cinque o sei repliche tecniche per ogni replica biologica in condizioni di controllo e trattate con etanolo, inclusi i controlli dei terreni per il confronto con BPTES.
Sciacquare le celle con terreno fresco o PBS per rimuovere detriti e celle galleggianti. Quindi aggiungere sei millilitri di terreno contenente siero al pallone T75 per nutrire le cellule. Usando un raschietto per cellule, staccare le cellule fino a quando il fondo del pallone non è libero.
Separare le cellule staccate pipettandole con una pipetta sierologica o una pipetta da un millilitro. Trasferire le celle sospese in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare a 200 G per sei minuti per pellettare le cellule. Quindi aspirare il surnatante dal pellet della cella di centrifugazione.
Aggiungere un millilitro di terreno al pellet e risospendere accuratamente le cellule. Trasferire 10 microlitri della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 10 microlitri di tripano blu e mescolare bene la soluzione.
Ora, trasferisci 10 microlitri della miscela di tripano blu cellulare su un lato di un emocitometro o di un contatore di cellule, per contare le cellule. Calcolare la diluizione richiesta in base al numero di pozzetti e cellule necessari utilizzando la formula mostrata qui. Quindi applicare 80 microlitri di cellule risospese nei pozzetti necessari nella piastra di microcoltura a flusso extracellulare a 96 pozzetti.
Incubare le cellule per una notte in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per consentire loro di aderire ed equilibrarsi nella piastra. Dopo il trattamento, rimuovere la parte superiore del flussante extracellulare e posizionare la parte sondata del flussante rivolta verso l'alto sul banco. Applicare 200 microlitri di soluzione calibrante del flusso extracellulare su ciascun pozzetto nella parte inferiore della cartuccia della confezione del flusso extracellulare.
Assemblare la cartuccia del flussante extracellulare riattaccando le sezioni e avvolgendola in Parafilm. Posizionare la cartuccia in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius, senza anidride carbonica, o in un bagno di perline, per equilibrarla. Infine, accendere il computer con il progetto del saggio e aprire il software di analisi collegato allo strumento bioanalizzatore di flusso extracellulare.
Inizia controllando le cellule MHS di controllo e trattate con etanolo per assicurarti che siano sane e aderiscano in un monostrato al microscopio. Per preparare il terreno base del flusso extracellulare, aliquotare 35 millilitri in una provetta da 50 millilitri. Aggiungere 350 microlitri ciascuno di piruvato di sodio da 100 millimolari, D-glucosio e GlutaMAX per la stabilità.
Scaldare la soluzione preparata a 37 gradi Celsius. Quindi aspirare delicatamente il terreno di coltura dalla piastra di microcoltura a flusso extracellulare, lasciando un minimo di terreno residuo senza disturbare le cellule. Lavare i pozzetti con un massimo di 50 microlitri di terreno base di flusso extracellulare.
Quindi, aggiungere 180 microlitri di terreno base di flusso extracellulare a ciascun pozzetto. Incubare la piastra di microcoltura extracellulare in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius, senza anidride carbonica, per 30 minuti a un'ora per consentire l'equilibrio. Aggiungere 700 microlitri di terreno base di flusso extracellulare al tubo BPTES per ottenere una soluzione madre da 120 millimolari.
Pipettare la soluzione per una corretta solubilizzazione. Quindi, aggiungere 630 microlitri di terreno base di flusso extracellulare alla provetta di oligomicina per preparare una soluzione madre da 100 millimolari e mescolare accuratamente. Quindi aggiungere 720 microlitri di terreno base di flusso extracellulare alla provetta FCCP per preparare una soluzione madre da 100 millimolari.
Pipettare la soluzione su e giù 10 volte per solubilizzare correttamente il composto. Aggiungere 540 microlitri di terreno base di flusso extracellulare alla provetta per AR per preparare una soluzione madre da 50 millimolari e miscelare mediante pipettaggio. Per preparare una soluzione di lavoro BPTES da 30 micromolari, mescolare 1.500 microlitri di terreno base di flusso extracellulare con 500 microlitri di soluzione madre BPTES da 120 millimolari.
Miscelare 2.520 microlitri di terreno base di flusso extracellulare con 480 microlitri di soluzione madre di oligomicina da 100 millimolari per creare una soluzione di lavoro da 16 millimolari. Quindi preparare la soluzione di lavoro FCCP mescolando 2.865 microlitri di terreno base integrato con flusso extracellulare con 135 microlitri di soluzione madre FCCP da 100 millimolari. Per preparare la soluzione di lavoro per l'artrite reumatoide, mescolare 2.700 microlitri di terreno basico integrato con flusso extracellulare con 300 microlitri di soluzione madre per l'artrite reumatoide da 50 millimolari.
Caricare i pozzetti di fondo, di controllo dei terreni e di cella con i reagenti mostrati qui. Le cellule di etanolo e BPTES-MHS hanno mostrato un tasso di consumo basale di ossigeno glutammina-dipendente inferiore e una respirazione mitocondriale legata all'ATP dalla glutammina rispetto alle cellule di controllo. Le cellule di etanolo e BPTES hanno mostrato una minore perdita nella respirazione massima e una ridotta capacità respiratoria di riserva glutammina-dipendente rispetto alle cellule di controllo.
