Questo protocollo può essere utilizzato per generare un modello di topo non casuale per testare e quantificare la riattivazione del cromosoma Mecp2 inattivo legato all'X nel cervello di un topo vivente. Questo modello può essere facilmente modificato per studiare la riattivazione di Xi in altri modelli di malattia legati all'X come la sindrome DDX3X. Sono un post doc nel laboratorio di Sanchita Bhatnagar e presenterò la procedura con Zeming Zheng.
Inizia posizionando il mouse anestetizzato in una piattaforma stereotassiva con gli incisivi agganciati nella barra del morso del limitatore del muso. Stringere il morsetto del naso mantenendo la testa del mouse su un piano piana. Regolare l'altezza delle barre dell'orecchio per raggiungere la porzione caudale del condotto uditivo per mantenere la testa immobilizzata.
Quindi disinfettare la testa con salviette alternate di un antisettico topico e 70%etanolo. Quando il mouse è pronto, utilizzare un bisturi sterile per fare un'incisione orizzontale di 0,75 centimetri nel cuoio capelluto medio. Utilizzare una bava di 0,45 millimetri per praticare due fori simmetrici sopra l'emisfero corticale destro e sinistro a due millimetri dalla sutura sagittale e la sutura lambdoide al centro approssimativo dell'osso parietale.
Attaccare saldamente una siringa da 10 microlitri alla piattaforma stereotassiva e caricare 10 microlitri di inibitore chimico appena preparato nella siringa. Far avanzare l'ago nel primo foro di bava mantenendo l'ago perpendicolare al cranio. Quando l'ago attraversa il cranio, azzerare le coordinate sul display digitale stereotattico e far avanzare la punta dell'ago fino a raggiungere una profondità di 2,5 millimetri.
Ritirare l'ago di 0,5 millimetri a una profondità di due millimetri e iniettare lentamente l'intero volume di 10 microlitri della soluzione per un periodo di un minuto. Dopo che tutto l'inibitore è stato consegnato, lasciare l'ago nel cervello per un altro minuto prima di ritirare l'ago. Ripetere l'iniezione nel secondo foro di bava utilizzando il veicolo solo come controllo e chiudere la pelle sull'incisione.
Quindi trasferire il mouse dall'apparato stereotattico su una pastiglia riscaldante Celsius di 37 gradi con monitoraggio fino al pieno recupero. Alla fine del regime di dose, fissare il mouse su una pastiglia di sezionazione. Usa forbici e forcette per fare un'incisione laterale attraverso il tegumento e la parete addominale appena sotto la gabbia toracica.
Separare accuratamente il fegato dal diaframma e tagliare il diaframma lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica. Utilizzare le forbici per fare un'incisione all'estremità posteriore del ventricolo sinistro e iniettare immediatamente la camera cardiaca destra con circa 15 millilitri di PBS per un periodo di due minuti. Una perfusione di successo comporterà un cambiamento del colore del fegato dal rosso al rosa pallido.
Una volta consegnato tutto il PBS, perfondere il cuore con circa 10 millilitri di paraformaldeide al 4% in PBS in due minuti. Dopo aver raccolto la testa, usa le forbici per fare un'incisione della linea mediana nel cuoio capelluto per esporre il cranio. Posizionare una punta delle forbici nel forame magnum per facilitare la creazione di un'incisione laterale nel cranio verso l'occhio.
Fai un'incisione simile sull'altro lato del cranio mantenendo l'estremità delle forbici il più superficiale possibile e taglia la regione del cranio tra gli occhi e sopra il naso del topo. Usa le forcep per sbucciare delicatamente le ossa cranici dagli emisferi cerebrali e usa una spatola per elevare il cervello. Sezionare attentamente le fibre nervose cranici che fissano il cervello al cranio e posizionare il cervello in un piatto di plastica.
Quindi asporta il cervelletto e i bulbi olfattivi. Per ottenere sezioni del tessuto cerebrale, prima fissare il cervello in un tubo da 15 millilitri riempito con paraformaldeide al 4% in PBS a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, sciacquare il tessuto cerebrale almeno tre volte per cinque minuti a quattro gradi Celsius in PBS fresco per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere la parte anteriore di ogni emisfero con forbici e forcep e posizionare i campioni in crio-stampi etichettati lato anteriore verso il basso. Immergere ogni tessuto in un mezzo di temperatura di taglio ottimale prima di congelare i campioni in azoto liquido in una piastra di Petri di plastica da 10 millimetri per uno stoccaggio di meno 80 gradi Celsius. Per determinare la riattivazione di Xi, immergere da cinque a sei sezioni di tessuto cerebrale micrometrico in soluzione di recupero dell'antigene per cinque minuti su un blocco termico di 100 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, lavare gli scivoli con quattro lavaggi di cinque minuti a temperatura ambiente con PBS fresco per lavaggio prima di immergere gli scivoli in soluzione di blocco. Dopo 20 minuti a temperatura ambiente, lavare gli scivoli tre volte per cinque minuti in tampone di lavaggio fresco per lavaggio. Macchiare i campioni di tessuto con gli anticorpi primari appropriati a quattro gradi Celsius durante la notte.
Immagini le diapositive su un microscopio a fluorescenza regolando il contrasto e la luminosità per consentire la quantificazione del numero di cellule positive GFP sia per gli emisferi cerebrali del topo trattati con farmaci che per veicoli. Per dimostrare la fattibilità del modello non casuale di topo di inattivazione cromosomico X per studi di riattivazione cromosomici X inattivi, i genotipi del fibroblasto embrionale di topo transgenico femminile sono stati confermati dalla genotipizzazione della PCR e dalla citometria del flusso. Come valutato dalla PCR, l'espressione della proteina legante GFP metilene CPG due geni o MECP2 è stata riattivata per farmaco ma non per trattamento con veicolo.
I fibroblasti embrionali del modello di topo di inattivazione cromosoma X non casuale hanno anche espresso GFP nucleare dopo il farmaco, ma non il trattamento del veicolo dimostrando che gli inibitori del fattore di inattivazione cromosoma X X riattivano il CROMOSOMA X inattivato collegato MECP2 nei fibroblasti embrionali di topo. Il trattamento farmacologico riattiva il cromosoma X inattivato MECP2-GFP in circa il 30% delle cellule negli emisferi cerebrali infusi di farmaci, mentre non viene rilevata alcuna riattivazione negli emisferi infusi del veicolo. Proteina associata al microtubulo due neuroni positivi sono anche positivi alla GFP negli emisferi trattati con farmaci indicativi dell'espressione inattivata del cromosoma X MECP2-GFP.
Il regime farmacologico dipenderà dal bersaglio e dall'efficacia degli inibitori delle piccole molecole, quindi ottimizza la dose e il trattamento in vitro prima di testare in vivo. Il modello di mouse non casuale può essere utilizzato per testare diversi farmaci singolarmente o in combinazione. In effetti, noi e altri abbiamo identificato diversi fattori di inattivazione cromosomici X farmacogabili.
