L'ECLIA è un metodo semplice ma efficiente per quantificare i livelli cellulari di MeCP2. L'ECLIA è veloce, più sensibile e più facile da maneggiare rispetto ad altri metodi di quantificazione come la macchia occidentale e l'ELISA. Per preparare la soluzione di lavaggio, che è dello 0,5% Tween 20 in PBS, aggiungere 500 microlitri di Tween 20 a un litro di PBS e mescolare vigorosamente.
Preparare una soluzione di blocco del 3%Blocker A e PBS e mescolare delicatamente. Sterilizzare la soluzione di blocco mediante filtrazione. Per preparare la soluzione diluita del test, 1%Blocker A e PBS, aggiungere cinque millilitri di soluzione di blocco a 10 millilitri di PBS.
Successivamente scongelare l'anticorpo monoclonale anti-MeCP2 sul ghiaccio. Mescolare 0,67 microlitri dell'anticorpo con quattro millilitri di PBS, quindi vortice la soluzione. Per rivestire la piastra di legante alta 96 po', erogare con cura 25 microlitri di soluzione di rivestimento nell'angolo inferiore di ogni pozzo, utilizzando un pipetter multicanale.
Tamponare delicatamente la piastra da 96 punti su ciascun lato per assicurarsi che la soluzione di rivestimento copra il fondo di ogni pozzo. Sigillare la piastra con un foglio adesivo e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Recuperare la piastra da 96 pozzi dal frigorifero e rimuovere il foglio.
Rimuovere la soluzione di rivestimento anticorpale nei pozzi facendola scorrere in un contenitore di rifiuti. Quindi toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere qualsiasi soluzione rimanente. Quindi, aggiungere 125 microlitri di soluzione di blocco a ciascun pozzo.
Quindi sigillare nuovamente la piastra con un foglio adesivo. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale a micropiastra, impostata a 800 giri/min, e incubarla per 90 minuti a temperatura ambiente. Scongelare sul ghiaccio una fiala della soluzione di stock proteico MeCP2 o Tat-MeCP2, i llysati cerebrali del topo e i llysati HDF.
Diluire la soluzione di stock proteico in tubi puliti come descritto nella tabella due del manoscritto. Quindi diluire i campioni di lysate. Per i liscivie cerebrali del topo, utilizzare da uno a 20 microgrammi per 25 microlitri di tampone di lisi.
Per il litolato HDF, aggiungere da 0,25 a un microgrammo per 25 microlitri di tampone dilisi. Dopo che la piastra da 96 pozzetti ha incubato per 90 minuti, rimuovere la soluzione di blocco dai pozzi facendola scorrere in un contenitore di rifiuti. Quindi toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere qualsiasi soluzione rimanente.
Quindi lavare la piastra tre volte con 150 microlitri di soluzione di lavaggio, aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendolo immediatamente. Aggiungere 25 microlitri di standard e campioni ai pozzi della piastra da 96 pozza. Sigillare la piastra e incubarla per altre quattro ore a temperatura ambiente con costante scuotimento di 800 giri/min.
Scongelare l'anticorpo di rilevamento non etichettato, il coniglio policlonale anti-MeCP2, sul ghiaccio. Utilizzando una soluzione diluita per test, diluire l'anticorpo con un rapporto tra uno e 6.000. Quando la piastra da 96 pozzetto ha finito di incubare sull'agitatore, rimuovere gli standard e i campioni facendo scorrere la piastra in un contenitore di rifiuti.
Quindi toccare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere qualsiasi soluzione rimanente. Lavare la piastra tre volte con 150 microlitri di soluzione di lavaggio aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendolo immediatamente. Aggiungere 25 microlitri di soluzione anticorpale di rilevamento senza etichetta a ciascun pozzo con il pipetter multicanale.
Sigillare la piastra e incubarla per un'ora a temperatura ambiente con scuotimento costante a 800 giri/min. Ottenere l'anticorpo secondario specifico dal frigorifero e posizionarlo un ghiaccio. Diluire il corpo secondario in soluzione diluita di saggio e mescolare delicatamente.
Per rimuovere l'anticorpo di rilevamento libero senza etichetta dalla piastra da 96 pozzetti, scorrere nel contenitore dei rifiuti e quindi toccare la piastra su un tovagliolo di carta. Dopo aver lavato la piastra tre volte come descritto perviosamente, aggiungere 25 microlitri di anticorpo secondario ad ogni pozzo con il pipetter multicanale. Sigillare la piastra e incubarla per un'ora a temperatura ambiente con scuotimento costante a 800 giri/min.
Rimuovere l'anticorpo secondario libero facendo scorrere nel contenitore dei rifiuti e toccando la piastra su un tovagliolo di carta e quindi lavare la piastra tre volte, come descritto in precedenza. Ad ogni pozzo della piastra, aggiungere 150 microlitri di 1X Tris base Gold Read Buffer con tensioattiva, contenente tripropilammina come coreactant per la generazione di luce. Per evitare di produrre bolle d'aria, utilizzare tecniche di pipettatura inversa.
Posizionare la piastra da 96 punti sulla piattaforma della micropiastra con il sistema di rilevamento dell'elettrochimica. Utilizzando la fotocamera CCD integrata, inizia immediatamente a catturare i dati. Conteggio dei segnali record che corrispondono alle unità di luce relative e sono direttamente proporzionali all'intensità della luce.
Le curve standard MeCP2 sono state generate dal MeCP2 umano in più misurazioni. L'ECLIA può quantificare accuratamente il MeCP2 umano ricombinante su un intervallo da un nanogrammo per millilitro a 1800 nanogrammi per millilitro. Utilizzando ECLIA, i livelli di proteine MeCP2 sono stati misurati in lisati nucleari cerebrali da topi eterozigoti e femmine di tipo selvatico e da un topo knockout MeCP2.
ECLIA è stato condotto su llysati cellulari da un controllo sano e dalla linea cellulare c. 806delG utilizzata come modello per la sindrome di Rett. Nessuna proteina MeCP2 è stata rilevata nelle linee cellulari mutanti dall'ECLIA o dall'immunofluorescenza.
Eclia è stato anche utilizzato per studiare l'assorbimento di Tat-MeCP2 da parte del MeCP2 carente di lavoro straordinario della linea cellulare. La precisione eclia inter e intra assay è stata determinata per tre giorni consecutivi. Per la futura terapia sostitutiva delle proteine, l'erogazione di MeCP2 può essere ripetutamente ottimizzata a seguito della valutazione del livello proteico da parte dell'ECLIA.
