Gli impianti cartilaginei rappresentano un metodo traslazionale facilmente accessibile per interrogare il rimodellamento dei tessuti nella matrice della cartilagine. Il metodo può fornire una visione precoce di come potenziali nuovi trattamenti influenzano la struttura articolare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la cartilagine rimane in un ambiente 3D nativo, che consente la profilazione dell'interazione tra le cellule e la matrice circostante utilizzando biomarcatori.
Il principio nel metodo non è unico per la cartilagine. Le espianto possono essere estratte da altri tessuti come un ovio, fegato e polmone e interrogate usando biomarcatori derivati dalla matrice. A dimostrare la procedura sarà Amalie Engstrom, studentessa del nostro laboratorio.
Eseguire l'intero processo di approvvigionamento tissutale al di fuori di una cappa di flusso laminare in un ambiente asettico. Da un macello locale, ottenere un'intera articolazione femorale femminile bovina fresca dai vitelli tra 1,5 e due anni. Quindi, sezionare delicatamente il ginocchio del polpaccio rimuovendo prima la carne in eccesso, scoprendo i condili, il menisco, i tendini e la membrana sinoviale.
Tagliare i tendini e la membrana sinoviale permettendo all'articolazione di smembrarsi. Rimuovere il menisco per esporre i condili femorali. Utilizzare un punzonatore per biopsia di tre millimetri per isolare le espianto dall'area portante dei condili femorali e rilasciarle dalla superficie auricolare tagliando con un bisturi parallelo e il più vicino possibile all'osso subcondrale.
Conservare e mescolare immediatamente le espianto in un mezzo di coltura glutimax DMEM F12 contenente 1%penicillina e streptomicina in un tubo da 50 millilitri o piastra di Petri. Per iniziare la coltura tissutale, trasferire le espianto su una piastra sterile da 96 pozzetti in una cappa di flusso laminare posizionando tutte le repliche all'interno di ciascun gruppo in diagonale per ridurre al minimo la variazione indotta dall'evaporazione. Aggiungere PBS ai pozzali esterni della piastra di coltura per evitare ulteriormente l'evaporazione del supernatante.
Quindi, lavare le espianto tre volte nel mezzo di coltura o PBS. Coltura gli espianto in 200 microlitri di mezzo di coltura per pozzo fino all'inizio dell'esperimento per un massimo di 10 settimane in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Se si applicano trattamenti, prepararli alla concentrazione desiderata nei pozzi di espianto per diluizione nel mezzo di coltura prima di cambiare il mezzo.
Cambia il mezzo di coltura ogni due o tre giorni in una cappa di flusso laminare. Rimuovere delicatamente il supernatante da ogni pozzo e trasferirlo su una nuova piastra da 96 pozza per lo stoccaggio. Aggiungere immediatamente 200 microlitri di mezzo di coltura fresco o trattamento ad ogni pozzo.
Non lasciare asciugare le espianto durante il cambio medio e assicurarsi che tutte le espianto siano completamente immerse nel nuovo mezzo. Sigillare la nuova piastra con nastro adesivo e conservarla a meno 20 gradi Celsius per l'analisi biomarcatore del turnover tissutale e dell'espressione proteica. Per iniziare un test di resazurina, creare una soluzione di supporto per coltura contenente il 10% di resazurina.
Raccogliere il supernatante come descritto in precedenza e immergere le espianto nella soluzione di resazurina al 10% a 37 gradi Celsius per tre ore o fino a quando i supernatanti diventano viola. Quindi, trasferire la soluzione di resazurina condizionata e di controllo dello sfondo su una piastra di microtitolo nero e misurare la fluorescenza ad un'eccitazione di 540 nanometri e un'emissione di 590 nanometri. Successivamente, immergere le espianto nel mezzo di lavaggio per cinque-10 minuti per consentire alla resazurina di diffondersi completamente e aggiungere nuovo mezzo di coltura o trattamenti se utilizzato.
Continuare a misurare l'attività metabolica una volta alla settimana come misurazione indiretta della vitalità cellulare. In questo studio, le espianto a piena profondità bovina vengono isolate, coltivate e trattate. Le espianto sono suddivise in quattro gruppi per il trattamento, compresi quelli trattati con Oncostatin M e fattore alfa di necrosi tumorale, quelli trattati con Oncostatina M e il fattore di necrosi tumorale alfa con GM 6001, quelli trattati con fattore di crescita dell'insulina uno e un controllo senza trattamento.
L'attività metabolica è relativamente stabile durante le tre settimane per tutti e quattro i gruppi. C'era una tendenza per L'IGF-1 ad aumentare e i gruppi O più T a diminuire rispetto al controllo. O più T viene quindi applicato ai pozzi di coltura tre volte a settimana per indagare sulla degradazione mediata della cartilagine O più T.
O più T è visto aumentare la degradazione del collagene di tipo due dal settimo al 21 ° giorno e la degradazione dell'aggrecan dai giorni da tre a 14 rispetto al gruppo di controllo. L'aggiunta di GM 6001 in combinazione con O più T blocca il rilascio del C2M mediato O più T, ma ha un effetto limitato su AGN X1 con livelli simili al gruppo O più T al giorno 10. L'insulina come fattore di crescita uno viene applicata tre volte alla settimana agli espianto a piena profondità bovina per indagare come la stimolazione anabolizzante moduli il fatturato ECM cartilagine.
L'effetto di IGF-1 sugli espianto di cartilagine è stato osservato principalmente sulle misurazioni della formazione di collagene di tipo due come previsto per gli stimoli anabolizzanti. Quando si tratta con IGF-1, i livelli pro-C2 diminuiscono meno di quelli osservati nel gruppo di controllo, indicando che IGF-1 stimola la formazione di collagene di tipo due dal settimo giorno. Gli espianto possono deteriorarsi nel tempo e quindi un'attenta pipettazione è fondamentale in tutte le fasi di trattamento e lavaggio per non perdere o distruggere le espianto nelle diverse fasi di scambio dei media.
I risultati generati utilizzando questo modello non dovrebbero essere autonomi, ma essere supportati dai dati generati nel tessuto umano, nonché cellulare e in modelli più recenti per convalidare ulteriormente i risultati. Per far luce sul meccanismo sottostante nel tessuto e non solo sui risultati, è possibile analizzare ulteriormente sia i tessuti che i supernanti usando altre tecniche di biologia molecolare, come l'analisi dell'espressione genica e proteica, o l'immunoistochimica, o altre tecniche permanenti di biologia molecolare.
