Ringraziamo Veronica Schreiter per la sua ottima assistenza tecnica e utili modifiche del modello di cultura tecnica e cella di crioconservazione stabilito. Inoltre, vorremmo ringraziare Maren Anders e Swanhild Rodewald per la loro eccellente assistenza tecnica nell'analisi successive.

Nota: Ovaie Bovine sono state ottenute da un macello commerciale. La raccolta di sottoprodotti di macellazione non richiede un'approvazione etica secondo la legge tedesca.
1. condizioni di lavoro e preparativi
<ol><li>Per garantire la sterilità, eseguire tutti i supporti e preparazione dei tessuti, così come tutta la cultura lavora in un laboratorio di cultura delle cellule specializzate utilizzando un banco di flusso laminare.</li>
	<li>Preparare 1 x tamponato fosfato salino (PBS, pH 7.4) completato con 100 UI di penicillina, 0,1 mg/mL di streptomicina e 0,5 µ g / µ l anfotericina per il trasporto delle ovaie. Nota: La durata massima tra ricevendo le ovaie e isolando il GC è 2h in questo set-up.</li>
</ol>2. isolamento delle cellule della Granulosa bovina
<ol><li>
Lavare le ovaie diverse volte in PBS 1X (con 100 UI di penicillina, 0,1 mg/mL di streptomicina e 0,5 µ g / µ l anfotericina) per rimuovere qualsiasi sangue dalla superficie prima di iniziare la procedura di isolamento. Utilizzare un becher, posizionare le ovaie all'interno, riempirlo con PBS 1X e scartare il PBS nuovamente.
	<ol>
<li>Ripetere questo passaggio di lavaggio 3 – 4 x, fino a quando le ovaie sono pulite da qualsiasi anima restante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulire un'ovaia servendosi di un panno di laboratorio imbevuto con alcool al 70%, per ridurre al minimo possibili contaminazioni.</li>
	<li>Con una siringa da 3 mL e un ago da 18 G, aspirare il GC da puntura follicoli di piccole e medie dimensioni (< 6 mm, misurato con un righello) e la piscina del liquido follicolare in un tubo di centrifuga da 50 mL. Nota: Per inumidire la siringa, prendere una piccola quantità di PBS 1X (con 100 UI penicillina, 0,1 mg/mL di streptomicina e 0,5 µ g / µ l anfotericina). Questo aiuta a raccogliere una piccola quantità di liquido follicolare e impedisce alle cellule di attaccarsi all'interno della siringa.</li>
	<li>Dopo parecchi follicoli di perforatura, risciacquare la siringa e l'ago con 1x PBS per pulizia intermedia.</li>
</ol>3. Crioconservazione delle cellule
<ol><li>
Utilizzare la colorazione blu di trypan e contare le celle sotto un emocitometro.
	<ol>
<li>Per contare il numero di cellule vitali, preparare una provetta con 1,5 µ l di una soluzione di blu di trypan 0.25%. Nota: Le cellule viventi rimarrà senza macchiate perché tripan blu può accedere solo la barriera delle cellule delle cellule morte, che poi appaiono blu.</li>
		<li>Aggiungere alla soluzione di blu di trypan 15 µ l della sospensione delle cellule della granulosa e mescolare delicatamente.</li>
		<li>Mettere il composto in entrambi gli alloggiamenti di un emocitometro. Contare il numero di vita (ad es., senza macchia) cellule in una grande piazza per camera. Nota: Anche se alcune cellule del sangue può essere visto, che si distinguono per la loro dimensione molto piccola.</li>
		<li>Calcolare il numero di cellule viventi con la media di entrambi i quadrati camera secondo le linee guida generali; la proporzione di cellule viventi può variare tra le ovaie ma deve superare i 60%13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prelevare un campione dal pool di cella di recente isolate della granulosa come riferimento per ulteriori analisi.
	<ol>
<li>A seconda il conteggio delle cellule del GC isolato, mettere da parte un numero adeguato di cellule come campioni di riferimento per la preparazione di proteine, DNA o RNA. Nota: Per l'isolamento di RNA e la successiva valutazione dell'espressione genica, 1 x 105 celle sono sufficienti, mentre altre successive analisi potrebbero richiedere numeri diversi, generalmente più elevati delle cellule.</li>
		<li>Inserire una o più aliquote di celle di riferimento in una nuova provetta e centrifugare esso per 1 min a temperatura ambiente e velocità massima (12.000 x g) per ottenere un pellet cellulare. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Immediatamente-congelamento dei campioni in azoto liquido. Conservare il campione a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eseguire la crioconservazione come segue.
	<ol>
<li>Preparare il supporto di congelamento utilizzando 80% siero fetale di vitello (FCS) e 20% di dimetilsolfossido (DMSO).</li>
		<li>Al fine di delicatamente a pellet il GC, centrifugare il GC per 3 min a temperatura ambiente e 500 x g.</li>
		<li>Rimuovere attentamente il supernatante e Risospendere delicatamente le cellule in 100% FCS (ad es., 1 mL) fino a nessuna cella più grumi sono visibili.</li>
		<li>Aggiungere 1 volume (ad esempio, 1 mL) del mezzo congelamento preparato alla sospensione cellulare e trasferire il composto in un vial criogeniche. Nota: La concentrazione finale di cryo-protezione media sarà 90% FCS e 10% DMSO.</li>
		<li>Posizionare la cuvetta criogenica in un contenitore di congelamento (disponibile in commercio) specializzato che previene il congelamento rapido. Il tasso di raffreddamento dei campioni non deve superare-1 ° C/min. da trasferire il contenitore di congelamento in un congelatore-80 ° C per almeno 4 ore.</li>
		<li>Per conservarli più a lungo, è possibile posizionare le fiale criogeniche in contenitori ultra-bassa temperatura (ad esempio, contenitori di azoto liquido fase). Nota: Il protocollo può essere fermato qui, come la crioconservazione permette di conservarli più a lungo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. preparazione dei supporti e piastre di coltura per la coltura delle cellule
<ol><li>
Piastre per colture cellulari cappotto con 0,02% collagene R. Nota: Collagene R sono conosciuta per essere essenziale per un allegato migliorato di GC nella cultura.<ol>
<li>Preparare una soluzione di R 0,02% collagene con acqua purificata adatto per colture cellulari.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (= 2cm2/bene) e garantire che l'intera superficie della cultura è ben coperto con la soluzione di collagene R.</li>
		<li>Lasciate che la soluzione a secco con il coperchio aperto per poche ore o durante la notte nella cappa a flusso laminare.</li>
		<li>Quando le piastre di coltura sono completamente asciutte, li irradiare con luce UV per 10 – 15 min minimizzare la contaminazione.</li>
		<li>Se necessario, è possibile memorizzare le piastre a 4 ° C fino a 2 mesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare i media e i supplementi per il lavoro di cultura sotto cappa a flusso laminare. Per un riuscito recupero del GC, devono essere trattati immediatamente dopo lo scongelamento.</li>
	<li>
Preparare i seguenti supporti.
	<ol>
<li>Supplemento mezzo essenziale α-Minimal (α-MEM) con 2 mM L-Glutammina, 0,084% di bicarbonato di sodio, 0,1% albumina di siero bovino (BSA), 20 mM HEPES, selenito di sodio 4 ng/mL, transferrina di 5 µ g/mL, 10 ng/mL insulina e gli amminoacidi non essenziali di 1 mM.</li>
		<li>Inoltre, è possibile aggiungere 100 UI di penicillina e 0,1 mg/mL di streptomicina ai media. Nota: Gli antibiotici, una volta riscaldati, sono stabili per circa 48 ore. Di conseguenza, aliquotare la quantità desiderata di media per il set-up cultura e media previsto scambio. Pre-riscaldare solo le aliquote di media a 37 ° C in un bagno d'acqua. I media preparati possono essere memorizzati a 4 ° C per non più di 3 mesi.</li>
		<li>Per indurre l'attività steroide in GC bovina coltivate, integrare il α-MEM ulteriormente con 20 ng/mL ormone follicolostimolante (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 e 2 µM androstenedione. Nota: Completare sempre questi componenti poco prima dell'inizio di uno scambio di cultura o supporti. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento per soluzioni di riserva di FSH e di IGF-1, in quanto ciò potrebbe compromettere l'attività steroide.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cellula cultura lavoro
<ol><li>Scongelare le cellule rapidamente in un bagno di acqua a 37 ° C per 3-4 min e trasferire la sospensione cellulare in α-MEM pre-riscaldato di 37 ° C (senza supplemento dell'ormone). Per centrifugazione, è consigliato un volume finale di 10 mL.</li>
	<li>Centrifugare il GC per 3 min a temperatura ambiente e a 500 x g. Scartare il surnatante. Aggiungere il α-MEM pre-riscaldato e completati e risospendere le cellule con attenzione.</li>
	<li>Seme del GC ad una densità di 1 x 105 o 1 x 106 cellule per pozzetto in un volume finale di 500 µ l. includono tecniche repliche di almeno tre pozzi di cultura a condizione.</li>
	<li>Incubare la coltura delle cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per 8 d.</li>
	<li>Eseguire un cambio di media ogni altro giorno. Sostituire solo i due terzi dei terreni di coltura per ridurre lo stress e per facilitare l'adattamento delle cellule ai media freschi. Nota: Il GC formano un fenotipo tipico di fibroblasto-come dopo un paio di giorni nella cultura e tendono a raggrupparsi insieme. Nella coltura delle cellule-ad alta densità, cluster di grandi dimensioni si trovano più frequentemente rispetto la cultura di densità normale GC (Figura 1, sinistra vs pannello di destra).</li>
</ol>6. la successiva analisi delle cellule della Granulosa coltivate
<ol><li>Per eseguire l'analisi dell'ormone steroide, raccogliere i media e congelare a-20 ° C. Utilizzare metodi appropriati per analizzare la concentrazione di estradiolo e progesterone nella media abbiamo trascorso [ad es., radioimmunoanalisi (RIA)]14.</li>
	<li>Per la successiva analisi di molecole differenti target (RNA, DNA, proteine, ecc.), lisare le cellule direttamente nella piastra di coltura con un appropriato agente lisante come consigliato dal fornitore. Nota: Per la maggior parte delle procedure di isolamento, è possibile interrompere il protocollo qui, come le cellule lisate possono essere conservate a-20 ° C per fino a 1 settimana. Per conservarli più a lungo, le cellule devono essere conservate a-80 ° C.</li>
	<li>Per determinare l'abbondanza di trascrizione, sintetizzare cDNA e misurare specifici trascritti da quantitativa in tempo reale della polimerasi reazione a catena (qPCR) tecniche15. Una valutazione statistica deve includere almeno tre repliche di culture differenti delle cellule, ha provenute da preparazioni di cellule diverse (replica biologici).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro.">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li><li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture.">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li><li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex.">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li><li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resource:+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes.">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li><li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+granulosa+cell+lines.">Ovarian granulosa cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).</li><li>Bernath, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+inhibits+fibronectin+gene+expression+in+a+newly+developed+granulosa+cell+line+by+a+mechanism+that+suppresses+cAMP-responsive+element-dependent+transcriptional+activation.">Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).</li><li>Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+between+freshly+isolated+and+spontaneously+immortalized+bovine+granulosa+cells:+protein+secretion,+steroid+metabolism,+and+responsiveness+to+growth+factors.">Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).</li><li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system:+induction+and+maintenance+of+estradiol+production,+response+to+follicle-+stimulating+hormone,+and+morphological+characteristics.">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li><li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media.">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li><li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell,+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited.">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li><li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro.">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li><li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells.">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells.">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li><li>Schneider, F., Br&#252;ssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts.">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li><li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density.">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage.">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).</li><li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions.">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li><li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il modello della coltura cellulare presentato fornisce uno strumento per analizzare di differenziazione delle cellule della granulosa in vitro. Diversi studi hanno mostrato che una coltura privo di siero è un prerequisito per il mantenimento dell'attività steroide in coltivate bovina GC o GC di altre specie8,9. Inoltre, rivestimento piastra di coltura con componenti della matrice extracellulare (ad es., collagene R)13, migliorato significativamente l'allegato delle cellule. Un'altra caratteristica importante è il periodo di coltura prolungata. Recentemente, è stato dimostrato che una coltura a lungo termine è necessaria ottenere sufficiente attività steroidogenica e un'espressione equilibrata di granulosa cella identità marcatori17. Sembra che il GC richiede il tempo per riprendersi dallo stress fisico durante la procedura di isolamento.
I supplementi di media FSH, IGF-1 e androstenedione sono conosciuti per indurre l'attività di aromatasi in coltivate GC. Soprattutto, il completamento con androstenedione è assolutamente necessario, come il GC bisogno un precursore per la sintesi di estradiolo. Questo è stato pubblicato in precedenza11,18 e, pertanto, non è stato ulteriormente studiato durante lo studio presente. Tuttavia, un adattamento del FSH, IGF-1 e concentrazioni di androstenedione potrebbe essere necessario per altre configurazioni sperimentali.
La tecnica di crioconservazione descritta qui può aiutare a migliorare l'organizzazione di esperimenti di coltura di tessuti rendendoli più indipendente dall'alimentazione varia con le ovaie. Secondo i test precedenti, crioconservazione non influisce il fenotipo GC o la produzione di steroidi nella cultura. Inoltre, l'abbondanza delle trascrizioni di marcatore in cellule coltivate non ha rivelato differenze significative confrontando campioni preparati dalle cellule di recente isolate con quelli precedentemente sottoposti a crioconservazione16.
Un parametro cruciale per l'attuale modello di cultura di GC è la cella densità di placcatura. Come dimostrano i Risultati di rappresentante, aumentando la densità di placcatura ha indotto notevoli cambiamenti delle caratteristiche fisiologiche e molecolari. Diversi geni sono regolati in modo specifico, le modifiche indotte da stimolazione della LH in vivo4,19di somiglianza. Il fatto che un aumento della densità delle cellule può guidare i processi di differenziazione-come in GC bovina coltivate è da considerarsi meticolosamente in questo modello in vitro di GC per evitare risultati conflittuali tra repliche. Di conseguenza, risultati contraddittori con altri studi potrebbero essere attribuiti alle densità differenti delle cellule e dovrebbero essere esaminati più da vicino.
Il modello di cultura descritto qui ha rivelato di essere non-responsivi agli LH, come le trascrizioni del recettore LHCGR sono vicini al limite di rilevazione. Quindi, una simulazione di limpulso del LH sia la situazione in vivo non è riuscito a indurre differenziazione13. Tuttavia, questo modello fornisce uno strumento utile per studiare i GC di estradiolo-attivo nella cultura primaria, in particolare come nessun funzionale bovina GC linee esistono allo stato attuale.
Protocolli di trattamento differenti possono essere testati nell'attuale modello di cultura di GC che aiutano a svelare i meccanismi di regolazione della produzione di steroidi o differenziazione di GC. Ulteriori, singoli fattori che sono coinvolti in processi di sviluppo possono essere analizzati separatamente. Pertanto, questo modello di cultura fornisce una base per molte applicazioni differenti.

Luteinization e ovulazione successo dipendono finemente sintonizzate e ben orchestrate alterazioni molecolari in tipi differenti delle cellule follicolari somatico. Poiché i dettagli di questi processi di sviluppo ancora completamente non sono capiti, sono necessari maggiori chiarimenti. Approcci in vivo sono elaborati e costosi e, in particolare, non riescono a meccanismi molecolari specifici di indirizzo che si verificano durante la follicologenesi. Di conseguenza, riduttivistico in vitro modelli sono necessari inoltre, per fornire la comprensione nei dettagli molecolari e cellulari. Diversi studi descrivono la cultura dei follicoli tutto nel contesto di in vitro fertilizzazione tecniche1,2,3. Perché i ricercatori sono interessati nei meccanismi di differenziazione, molti studi si concentrano su GC follicolare. Queste cellule, direttamente connesse con l'ovocita, sono le principali fonti di produzione di estrogeni e, pertanto, svolgono un ruolo essenziale in tutto follicologenesi e luteinization4.
Immortalata cella da diverse specie sono state sviluppate linee di GC. La maggior parte di loro, tuttavia, non mostrano un sufficiente ormone steroide produzione5. Finora, solo una varietà di cellula di bovini che GC è stata stabilita6, ma questa linea ha perso la sua attività steroidogenica dopo diversi passaggi7. Pertanto, poiché la steroidogenesi e, in particolare, produzione di estradiolo è una caratteristica essenziale delle funzionalità di GC, si consiglia di studiare questi aspetti in modelli di coltura cellulare primaria. Negli studi precedenti, è stato dimostrato che una produzione considerevole di estradiolo possa essere osservata solamente sotto coltura privo di siero circostanze8,9. Ulteriormente, il completamento di un precursore della sintesi di estradiolo è un altro requisito, come GC non riescono ad esprimere l'enzima necessario che può convertire il progesterone in androstenedione10. Inoltre, l'effetto sinergico di FSH e IGF-1 il completamento in vitro ha rivelato un'attività ottimizzata dell'aromatasi, l'enzima chiave della sintesi di estradiolo11. Nel presente protocollo, altri importanti fattori che hanno un impatto sostanziale sul modello GC cultura inoltre sono descritti. In particolare, la cella densità di placcatura ha enormi effetti sull'esito dell' esperimento12. Inoltre, una tecnica di crioconservazione di bovino GC che non interferisce significativamente con la fisiologia di GC nella cultura potrebbe essere stabilita. Questa tecnica aiuta a migliorare l'organizzazione del lavoro della coltura delle cellule e per ottimizzare la densità di placcatura preferito.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 182-05</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin (250 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2612</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe (Omnifix Luer)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>Roth</td>
			<td>C724.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-preservation vials (2 ml)</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 89020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX cell freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture dish, 24-well, flat bottom</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen R (0.2 %)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>F 0915</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin (200 mM)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1713</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1603</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin (10 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516</td>
			<td>dissolved in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEA</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0293</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4021</td>
			<td>we prefer to use a stock solution of 2 &#181;g/ml, diluted in 0.9 % NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR3-IGF-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1146</td>
			<td>we use a stock solution of 2 &#181;g/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>androstenedione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46033</td>
			<td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

Cellule della granulosa ovarica (GC) sono la fonte principale di sintesi di estradiolo. Indotto dall'ondata preovulatorio dell'ormone luteinizzante (LH), le cellule della teca e, in particolare, dello strato delle cellule della granulosa profondamente cambiano le loro caratteristiche morfologiche, fisiologiche e molecolari e formano il corpus della produzione di progesterone luteo che è responsabile per il mantenimento della gravidanza. Modelli di coltura cellulare sono strumenti essenziali per studiare i meccanismi normativi coinvolti nella trasformazione folliculo-luteale. Il protocollo presentato si concentra sulla procedura di isolamento e criopreservazione di bovino GC da follicoli di piccole e medie dimensioni (< 6 mm). Con questa tecnica, una popolazione quasi pura di GC possa essere ottenuta. La procedura di crioconservazione facilita notevolmente il tempo di lavoro indipendente di una fornitura di tessuto (ovaie) diretta primaria gestione della coltura delle cellule. Questo protocollo descrive un modello di coltura privo di siero cellulare che simula lo stato di estradiolo-attivo di bovino GC. Condizioni importanti che sono essenziali per una cultura di successo steroide-attivo delle cellule sono discussi in tutto il protocollo. È dimostrato che aumentando la densità di placcatura delle cellule induce una risposta specifica, come indicato da una produzione dell'ormone e del profilo di espressione gene alterato. Inoltre, questo modello fornisce una base per ulteriori studi sulla differenziazione di GC e altre applicazioni.

GC placcati al display di 1 x 105 cellule/pozzetto un aspetto tipico del fibroblasto-come in quanto formano un'estensione di cella paragonabile ai fibroblasti e tendono a costruire cluster (Figura 1a e 1C). Aumentando la densità di placcatura di 10 volte a 1 x 106 cellule/pozzetto non cambiare la morfologia ma più mazzi delle cellule possono essere osservati (Figura 1b e 1D, frecce). Come già indicato in una precedente pubblicazione, il rivestimento di collagene i piatti di cultura in gran parte migliorata l'allegato delle cellule13.
Crioconservazione iniziale non ha cambiato notevolmente le caratteristiche fisiologiche delle cellule in cultura rispetto a quelli coltivati direttamente da campioni di recente isolati. Questo è illustrato nella Figura 2 come l'abbondanza di trascrizione (misurato da qPCR) del marcatore diversi geni non hanno differito quando confrontando le cellule coltivate derivate dalle piscine appena isolate o congelate.
Figura 3 Mostra risultati rappresentativi dell'analisi dell'ormone steroide (misurato da RIA) in bovini GC coltivate a normale vs ad alta densità. La concentrazione di estradiolo è diminuita significativamente nella cultura ad alta densità rispetto alla cultura normale-densità, mentre la produzione di progesterone hanno teso ad essere più alto.
Un'analisi comparativa dei diversi geni (misurato da qPCR) in alto - vs culture normale densità ha rivelato un effetto significativo (Figura 4). CYP19A1, codifica l'enzima chiave della biosintesi di estradiolo aromatasi, come pure il recettore di gonadotropina FSHR, erano significativamente giù-regolato. Al contrario, i geni RGS2 e VNN2 hanno mostrato un su-regolamento significativo. Questi risultati indicano chiaramente che specifici processi di differenziazione cellulare sono indotta aumentando la densità di placcatura di cella.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Figura 1: coltivate le cellule della granulosa bovina a normale (pannelli a sinistra) e delle cellule ad alta densità (pannelli di destra). (a e c) cellule coltivate ad una densità di 1 x 105 cellule/pozzetto visualizzato un tipico del fibroblasto-come il fenotipo. (b e d) GC coltivate a una placcatura ad alta densità (1 x 106 cellule/pozzetto) tendeva a formare ammassi a grandi cellule (frecce) più frequentemente rispetto alle cellule sotto una densità normale (pannello di sinistra). Scala bar = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Figura 2: confronto delle cellule coltivate direttamente dopo l'isolamento e dopo crioconservazione. Le cellule sono state coltivate ad una densità di 1 x 105 cellule per pozzetto. L'espressione genica di diverse trascrizioni di marcatore è stata valutata e non rivelato alcuna differenza tra cellule coltivate con o senza un iniziale crioconservazione. Il boxplot Mostra la mediana di n = 3. Di due code Student t-test, il p-valori sono inclusi. Questa figura è riprodotto dal Baufeld e Vanselow imperiale16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Figura 3: concentrazione di ormone steroide in cellule della granulosa coltivate a densità differente di placcatura. La concentrazione di estradiolo (E2) è diminuito significativamente quando il GC sono state coltivate ad una densità elevata delle celle, mentre la concentrazione di progesterone (P4) solo ha teso ad essere più alto. La concentrazione di ormone è stato corretto per il contenuto di DNA normalizzare per i numeri di cellulari diversi. La media e la SEM di n = 3 sono mostrati. p > 0.05, di due code Student t-test. Questa figura è riprodotto dal Baufeld et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Figura 4: Abbondanza di trascritti funzionali chiave nelle cellule della granulosa coltivate a un normale vs una densità alta placcatura. Bovina GC coltivato nelle circostanze senza siero per 8 d ha rivelato un regolamento specifico dei diversi geni marcatori selezionati. Il boxplot Mostra la mediana di n = 3 ripetizioni individuali. p < 0.05, di due code Student t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

È descritto un modello di coltura a lungo termine delle cellule della granulosa bovina nelle circostanze senza siero. Questo modello permette ai ricercatori di studiare gli effetti dei diversi fattori e condizioni come densità differente di placcatura sulle caratteristiche della produzione di estrogeno delle cellule della granulosa bovina.

Un modello di coltura del tessuto della produzione di estrogeno primario bovina Granulosa Cells

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

a-tissue-culture-model-estrogen-producing-primary-bovine-granulosa

Research

JoVE Journal

Biology

9.0K Views.  Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN). È descritto un modello di coltura a lungo termine delle cellule della granulosa bovina nelle circostanze senza siero. Questo modello permette ai ricercatori di studiare gli effetti dei diversi fattori e condizioni come densità differente di placcatura sulle caratteristiche della produzione di estrogeno delle cellule della granulosa bovina.

Video: A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Ricerca

Biologia

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

Colture primarie di cellule corticosurrenali ratto e saggi di Steroidogenic funzioni

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique tissue important for proper function of the synovial joint and is constituted by a dense extracellular matrix (ECM), rich in proteoglycan and type II collagen. Chondrocytes are the only cell type present within cartilage and are widespread and relatively low in number. Altered external stimuli and cellular signalling can lead to changes in ECM composition and deterioration, which are important pathological hallmarks in diseases such as osteoarthritis (OA) and rheumatoid arthritis.
Ex vivo cartilage models allow 1) profiling of chondrocyte mediated alterations of cartilage tissue turnover, 2) visualizing the cartilage ECM composition, and 3) chondrocyte rearrangement directly in the tissue. Profiling these alterations in response to stimuli or treatments are of high importance in various aspects of cartilage biology, and complement in vitro experiments in isolated chondrocytes, or more complex models in live animals where experimental conditions are more difficult to control.
Cartilage explants present a translational and easily accessible method for assessing tissue remodeling in the cartilage ECM in controllable settings. Here, we describe a protocol for isolating and culturing live bovine cartilage explants. The method uses tissue from the bovine knee, which is easily accessible from the local butchery. Both explants and conditioned culture medium can be analyzed to investigate tissue turnover, ECM composition, and chondrocyte function, thus profiling ECM modulation.

Here, we present a protocol describing isolation and culturing of cartilage explants from bovine knees. This method provides an easy and accessible tool to describe tissue changes in response to biological stimuli or novel therapeutics targeting the joint.

Un modello di cultura del tessuto Ex Vivo di Cartilage Rimodellamento in Esplants bovina del ginocchio

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Raccolta di tessuti di pipistrelli per -Omics Analyses e Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Induzione e rilevamento dell'apoptosi in una cultura primaria delle cellule intestinali del cetriolo marino

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Coltura tissutale della corteccia ovarica bovina

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Coltura primaria di cellule epiteliali pigmentate retiniche suine

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...