Il nostro protocollo descrive la modificazione genetica delle cellule CAR-T durante la loro produzione attraverso la tecnologia CRISPR per generare prodotti più efficaci e meno tossici. Un vantaggio di questa tecnica è che la produzione di cellule CAR-T e la manipolazione genetica possono verificarsi entrambe in una cellula con una buona efficienza. A dimostrare la procedura saranno Rosalie Sterner, dottoranda, Michelle Cox, tecnologa e studentessa laureata, e Reona Sakemura, post-dottorato, del mio laboratorio.
Dopo aver isolato le cellule T dalle cellule mononucleari del sangue periferico raccolte, inizia a coltivarle preparando prima il mezzo a cellule T e poi sterilizzandole filtrandole attraverso un filtro sterile sottovuoto da 0,45 micrometri e poi con un filtro sottovuoto sterile da 0,22 micrometri. Il giorno della stimolazione delle cellule T o del giorno zero, prima della stimolazione, lavare le perline CD3/CD28 posizionando il volume richiesto di perline in un tubo sterile di microcentrifugo da 1,5 millilitri e rimosintendo in un millilitro di TCM. Posizionare il tubo a contatto con un magnete per un minuto.
Quindi aspirare il TCM e rimescolare in un millilitro di TCM fresco per lavare di nuovo le perline e ripetere per un totale di tre lavaggi. E infine, rimospendare le perline in un millilitro di TCM. Dopo aver contato le cellule T, trasferire le perline alle cellule T con un rapporto di tre a una perline con le cellule.
Quindi diluire le cellule a una concentrazione finale di un milione di cellule per millilitro e incubare a 37 gradi Celsius, 5%CO2 per 24 ore. Dopo aver acquisito un costrutto CART19 in un vettore lentivirale, eseguire la produzione lentivirale incubando prima il plasmide lentivirale, il vettore di imballaggio, il vettore dell'inviluppo, il reagente precomplesso, il reagente di trasfezione e il mezzo di trasfezione a temperatura ambiente per 30 minuti. Eseguire lavori lentivirali utilizzando precauzioni BSL2+, tra cui cappe di coltura cellulare, dispositivi di protezione individuale e disinfezione di materiali usati con candeggina prima dello smaltimento.
Dopo l'incubazione, aggiungere questi reagenti di trasfezione alle 293 cellule T che hanno raggiunto il 70-90% di confluenza e coltura le cellule trasfette a 37 gradi Celsius e 5%CO2. A 24 e 48 ore dalla trasfezione, raccolta, centrifuga, filtra e concentrato il supernatante contenente virus mediante ultracentrifugazione e congelare a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro. Il primo giorno, rimorsiva delicatamente le cellule T che sono state stimolate a un milione di cellule per millilitro il giorno zero al fine di rompere le rosette delle cellule.
In base alle opportune precauzioni BSL2+, aggiungere virus raccolto fresco o congelato alle cellule T simulate a una molteplicità di infezione di 3.0. Continuare a incubare le cellule T trasdotto a 37 gradi Celsius, 5%CO2. Nei giorni tre e cinque, contare le cellule CAR-T e aggiungere TCM fresco pre-riscaldato alla coltura per mantenere una concentrazione cellulare CAR-T di un milione di cellule per millilitro.
Sei giorni dopo la simulazione, rimuovere le perline dalle cellule T trasdotto raccogliendo e riutilizzando le cellule. Trasferire le celle in tubi conici da 50 millilitri e posizionare i tubi in un magnete per un minuto. Dopo aver raccolto il supernatante contenente cellule CAR-T e aver scartato le perline, riposizionare le cellule in coltura ad una concentrazione di un milione di cellule per millilitro in un pallone di coltura.
Utilizzare un campione di cellule per la citometria del flusso per valutare l'espressione superficiale dei CATE. Incubare il resto per riprendere l'espansione e quindi raccogliere e crio-preservare le cellule all'ottavo giorno come descritto nel manoscritto. Per interrompere il fattore stimolante della colonia di macrofagi granulociti, utilizzare un RNA guida come descritto nel manoscritto.
Incubare i reagenti di trasfezione a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungili alle 293 cellule T che hanno raggiunto la confluenza dal 70 al 90% e coltivi le cellule trasfette a 37 gradi Celsius, 5%CO2 per produrre un lentivirus. A 24 e 48 ore, raccogliere e concentrare il supernatante contenente virus mediante ultracentrifugazione in tubi ultracentrifugi da 50 millilitri e congelare a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro.
Quindi, il primo giorno, rimospensì delicatamente le cellule T per rompere le rosette. In un laboratorio approvato da BSL2+, per generare cellule CAR-T, aggiungere il lentivirus CAR19 e il lentivirus CRISPR mirato al GMCSF alle cellule T simulate. Il terzo e quinto giorno per le cellule T modificate lentiCRISPR con successo che trasportano resistenza alla puromicina, trattare le cellule con puromicina diidrocloruro ad una concentrazione di un microgrammo di puromicina per millilitro.
Il sequenziamento delle maree è stato utilizzato per confermare una riduzione GM-CSF delle cellule CART19 knockout GM-CSF con un'efficienza di interruzione di circa il 71% I grafici di flusso della colorazione della superficie cellulare CAR-T gated su cellule positive CD3 in diretta mostrano che sia cart19 di tipo selvaggio che GM-CSF knockout CART19 con successo e in modo simile esprimono il recettore di superficie CAR in vitro. D'altra parte, la colorazione intracellulare di GM-CSF per citometria a flusso gated anche su cellule positive cd3 in diretta dimostra una diminuzione dell'espressione di GM-CSF nelle cellule knockout rispetto alle cellule CART19 di tipo selvatico che confermano il successo funzionale del knockout. Particolare attenzione dovrebbe essere presa durante le fasi di trasduzione di questa procedura in quanto sono le più critiche per lo sviluppo di cellule CAR-T geneticamente modificate.
La metodologia descritta può potenzialmente essere applicata a una varietà di geni per modificare le cellule CAR-T tramite CRISPR/CAS9 per aiutare a generare un prodotto meno tossico e più efficace. La tecnologia CRISPR/CAS9 fornisce le strategie per indirizzare direttamente il genoma delle cellule CAR-T per progettare soluzioni alle attuali carenze cliniche.
