Questo protocollo descrive i passaggi chiave nella generazione e ottimizzazione di vettori sgRNA efficienti. La nostra preaccelerazione dello sgRNA candidato mira al tempo relativo e all'inferenza. Il vantaggio principale di questo protocollo è che consente di analizzare le impressioni di codifica del DNA per ciascuno degli sgRNA senza modificare i geni endogeni.
Questo metodo di preselezione può anche essere applicato ad altre misure di editing genico attraverso pause a doppio filamento. Inizia diluire gli oligonucleotidi liofilizzati a una concentrazione finale di 10 micromolari in acqua doppia distillata. Mescolare oligonucleotidi in avanti e inverso in un tubo PCR a parete sottile con un rapporto uno a uno senza aggiungere alcun buffer aggiuntivo.
Incubare la miscela a 95 gradi Celsius per cinque minuti, quindi scendere la temperatura a 72 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere la miscela di oligonucleotidi dalla macchina PCR e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Per digerire il vettore pX330-xCas9, con Bbs1, combinare il vettore, l'enzima e il buffer di digestione in un volume di 50 microliter e incubare la reazione a 37 gradi Celsius per due ore.
Dopo aver eseguito la trasformazione cellulare, scegli da cinque a 10 colonie batteriche dalla piastra LB e usa ognuna di esse per inoculare un millilitro di mezzo LB con ampicillina da 60 milligrammi in un tubo da 1,5 millilitri. Quindi incubare i tubi su uno shaker rotante per due o tre ore. Eseguire PCR sullo schermo per i plasmidi ricombinanti come descritto nel manoscritto di testo, quindi eseguire i prodotti su un gel di agarosio al 2% sotto i 10 volt per centimetro.
Dopo aver identificato i plasmidi positivi, usali, insieme a un vettore reporter, per co-trasfetto una linea cellulare appropriata. Per lyse le cellule, rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule coltivate. Lavare delicatamente la superficie del contenitore di coltura con PBS e distribuire 100 microlitri di PLB in ogni bene di coltura per coprire completamente lo strato mono cellulare.
Lasciare incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi trasferire il lisato su un tubo o una fiala per un'ulteriore manipolazione o conservazione. Per eseguire il saggio della doppia luciferasi, programmare i luminometri per fornire un ritardo di pre-lettura di due secondi seguito da un periodo di misurazione di 10 secondi. Quindi, erogare 100 microlitri di reagente di saggio luciferasi nel numero appropriato di tubi luminometrici.
Aggiungere con cura 20 microlitri di lysate cellulare nel tubo del luminometro e mescolare pipettando due o tre volte. Posizionare il tubo nel luminometro e avviare la lettura. Rimuovere il tubo campione dal luminometro.
Aggiungere brevemente 100 microlitri di reagente di arresto e vortice da mescolare. Riportare il campione al luminometro e iniziare la lettura. Registra l'attività della Renilla Luciferase, normalizzata con l'attività della Lucciola Luciferasi, in particolare il reciproco del rapporto visualizzato sullo schermo.
Scartare il tubo di reazione al termine. Questo metodo è stato utilizzato per generare tre vettori di sgRNA per pecore DKK2 Exon 1. i vettori di espressione sgRNA e xCas9 sono stati costruiti pre-digerendo la dorsale vettoriale seguita legandolo in una serie di frammenti di DNA a doppio filamento corti attraverso coppie di oligo di ricottura.
Sette colonie batteriche sono state schermate con una specifica PCR guidata a coppia di primer e sono state rilevate colonie positive. Le capacità di targeting genico di pX330-xCas9 T1, T2 e T3 sono state rilevate simultaneamente con il saggio della doppia luciferasi. L'ultimo vettore sgRNA mostrava il segnale di rilevamento più alto ed è stato successivamente utilizzato per la ricerca sull'editing genico delle pecore.
Seguendo questo protocollo, è possibile eseguire un saggio T7EI o un saggio di ribonucleasi. Queste misure aggiuntive danno impressioni più accurate sull'editing di geni endogeni.
