Ringraziamo Kymberlee O&#39;Brien, Celia Moore, e Edward Tronick (Dipartimento di Psicologia, University of Massachusetts, Boston) per fornire i campioni di capelli umani analizzati in questo studio, e Stephen Suomi e Amanda Dettmer (Laboratorio di Etologia Comparativa, NICHD) per fornire i campioni di capelli scimmia rhesus. Sviluppo iniziale e l&#39;uso continuato di questo metodo è stato sostenuto da NIH RR11122 MAN

1. Raccolta dei campioni e conservazione <ol><li> Capelli umani <ol><li> Fissare l&#39;intera lunghezza dei capelli da campionare (fino a una matita larghezza di diametro) con un elastico o clip. Tagli capelli vicino al cuoio capelluto il più possibile (facendo attenzione a non intaccare la pelle), con un paio di forbici pulite. Nota: L&#39;area di campionamento standard è il vertice posteriore del cranio. </li><li> Alcuni ricercatori hanno segnalato una diminuzione dei livelli di CORT capelli umani con la distanza dal cuoio capelluto 6, che può essere dovuto a dilavamenti da ripetute esposizioni all&#39;acqua e shampoo 7 (anche se vedi Manenschijn et al. 8 e Thomson et al. 9 per i risultati contrari a che è stato osservato alcun calo segmentale) Per ridurre al minimo l&#39;impatto di questo potenziale &quot;effetto washout&quot;, si consiglia di raccogliere i segmenti di capelli prossimale al cuoio capelluto con una lunghezza non superiore a 3 cm (ipotizzando un tasso di crescita media di 1 cm / mese 10, di un 3 segmento cm contiene CORT che è stato depositato su circa degli ultimi 3 mesi). Per fare questo, utilizzare un righello per misurare 3 cm dal primo taglio e tagliare di nuovo per cedere il campione tre centimetri. Nota: Una volta che i capelli sono stati tagliati a misura, non è più necessario mantenere i fili allineamento meno che lo studio comporta il taglio del campione in segmenti di 1 cm di lunghezza separati per stabilire un calendario retrospettiva di CORT deposizione nel periodo di tempo prima del campionamento 6. </li><li> Posizionare il campione di capelli in un sacchetto realizzato in alluminio, una busta di carta pulita, o 15 ml con tappo a vite in polipropilene tubo da centrifuga del tipo utilizzato per il campione di lavaggio. Come CORT è estremamente stabile in capelli 2, i campioni possono essere conservati indefinitamente a -20 ° C e, se necessario, spedito notte a temperatura ambiente. </li><li> La procedura di raccolta dei capelli dovrebbe essere praticata sui volontari ed i campioni di pratica deve essere valutato prima di imbarcarsi su uno studio completo. Nota: I campioni di capelli come small come 5-10 mg può essere analizzata utilizzando i metodi qui descritti, anche se è desiderabile raccogliere campioni&gt; 10 mg per ridurre al minimo la probabilità di ottenere letture EIA sotto del livello più basso CORT. </li></ol></li><li> Capelli Scimmia <ol><li> Radersi i capelli (100-250 mg) dalla nuca con un clipper animale standard. Shave più vicino alla pelle il più possibile, facendo attenzione a non intaccare la pelle e causare sanguinamento perché i livelli di CORT sangue sono estremamente elevati rispetto a quelli trovati nei capelli. Nota: La zona del collo è stata scelta per il campionamento di routine perché è generalmente una buona fonte di capelli e può essere facilmente osservato per la ricrescita dei capelli prima ricampionamento. </li><li> Collocare il campione di capelli in un sacchetto in carta stagnola o 15 ml con tappo a vite in polipropilene provetta. Campioni di capelli scimmia devono essere immagazzinati e spediti nello stesso modo come sopra descritto per i campioni di capelli umani. </li><li> Perché i capelli scimmia, a differenza capelli delle persone, si sviluppa per una certa lunghezza e poi stops crescenti 11, non è generalmente possibile in questo caso utilizzare la distanza dalla pelle come un calendario per CORT deposizione. Tuttavia, se un animale può essere campionato più di una volta (per esempio, durante periodici esami sanitari di routine), è opportuno effettuare una rasatura iniziale per impostare un punto di tempo basale e poi reshave stessa zona dopo che è trascorso il periodo di tempo desiderato. CORT nel secondo campione è stato depositato durante l&#39;intervallo di rasatura-reshave, che permette una precisa attribuzione di contenuti CORT del campione all&#39;attività HPA oltre quell&#39;intervallo 5. </li></ol></li></ol> 2. Lavaggio del campione ed asciugatura <ol><li> Lavaggio <ol><li> Collocare ogni campione di capelli in un 15 ml con tappo a vite in polipropilene provetta. </li><li> Aggiungere 5 ml di cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)-grade isopropanolo a ciascuna provetta seguita da inversione ripetuta per 3 min usando un rotatore. </li><li> Versare il isopropanolo in un contenitore di rifiuti, tenendo csono di non perdere alcuna del campione. </li><li> Ripetere i punti 2.1.2 e 2.1.3, una volta di più. </li></ol></li><li> Essiccazione <ol><li> Asciugare i capelli per almeno 2-3 giorni per garantire la completa evaporazione isopropanolo. </li></ol></li></ol> 3. Rettifica campione e CORT estrazione - Metodo 1 per grandi campioni <ol><li> Macinazione del campione <ol><li> Posizionare fino a 250 mg di capelli secchi in un 10 ml di macinazione in acciaio inox vaso con un singolo di macinazione sfera in acciaio inox 12 millimetri. </li><li> Macinare il campione per 6 minuti ad una velocità di 25 Hz utilizzando un mulino a palle. </li><li> Pesare fino a 50 mg di capelli in polvere su una bilancia analitica e poi trasferirlo in un ambiente pulito 2,0 ml in polipropilene provetta per l&#39;estrazione CORT successiva. </li></ol></li><li> Estrazione CORT <ol><li> Aggiungere 1,0 ml di metanolo per HPLC per la provetta contenente il campione in polvere. </li><li> Chiudere la provetta e incubare il campione per 18-24 ore a temperatura ambiente con coinversione nstant utilizzando un rotatore. </li><li> Centrifugare a 14.000 rpm per 1 min a temperatura ambiente per far sedimentare i capelli in polvere. </li><li> Trasferire 0,6 ml di surnatante in un ambiente pulito da 1,5 ml provetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet di capelli in polvere. </li></ol></li></ol> 4. Rettifica campione e CORT estrazione - Metodo 2 per i piccoli campioni <ol><li> Macinazione del campione <ol><li> Posizionare fino a 60 mg di capelli in un pre-pesate 2 ml provetta rinforzato per tallone pestaggio. </li><li> Pesare il flaconcino per ottenere il peso del campione. </li><li> Aggiungere tre perle 3,2 millimetri in acciaio cromato ad ogni flacone e poi macinare il campione per almeno 2 minuti in un battitore tallone. Se il controllo visivo rivela che il campione non è sufficientemente polverizzato, quindi eseguire macinazione supplementare per 0,5 o 1 min. Nota: Nessun trasferimento dei capelli terreno è necessaria in questo caso perché CORT estrazione viene eseguita nello stesso flaconcino come macinazione. </li></ol&gt; </li><li> Estrazione CORT <ol><li> Aggiungere 1,5 ml di metanolo per HPLC per la provetta contenente il campione in polvere. </li><li> Chiudere la provetta e incubare il campione per 18-24 ore a temperatura ambiente con costante inversione usando un rotatore. </li><li> Centrifugare a 10.000 rpm per 5 min a temperatura ambiente per far sedimentare i capelli in polvere. Nota: Le perle acciaio cromato rimangono nel tubo con i capelli durante le fasi di estrazione e centrifugazione, che rappresenta la velocità di centrifugazione inferiore rispetto al metodo 1. </li><li> Trasferire 1,0 ml di surnatante in un ambiente pulito da 1,5 ml provetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet di capelli in polvere. </li></ol></li></ol> 5. L&#39;evaporazione del solvente e Ricostituzione del campione <ol><li> Essiccare per metanolo utilizzando un evaporatore sotto vuoto o un flusso di gas azoto se un evaporatore sotto vuoto non è disponibile. Se si utilizza un evaporatore sotto vuoto, il vapore metanolo può essere intrappolato mediantedi una trappola a freddo o una trappola chimico dotato di cartuccia di carbone attivo. </li><li> Dopo la rimozione del metanolo, ricostituire l&#39;estratto CORT in un volume adeguato di tampone EIA (test di diluente). Se sono previsti valori relativamente elevati CORT, quindi utilizzare un volume di tampone di 0,4 ml o superiore. Se sono previsti valori relativamente bassi, allora il volume può essere ridotto a 0,2 ml o meno per aumentare la sensibilità. Nota: 0.2 ml di volume è sufficiente per eseguire aliquote duplicati del campione almeno due volte nel caso in cui è necessaria una replica del campione. </li><li> O saggiare il campione ricostituito immediatamente o congelarlo a -20 ° C per una successiva analisi. Nota: Se il campione ricostituito è congelato, è importante evitare sublimazione durante il periodo di congelamento da una alterazione del volume campione è causa di un valore CORT falsa quando vengono eseguiti i calcoli finali. </li></ol> 6. CORT Assay e conversione dei dati <ol><li> Analizzare i capelli con estratti diCORT con un alta sensibilità immuno-enzimatico (EIA) kit. Nota: Se si utilizza un salivare commerciale kit CORT EIA, seguire le raccomandazioni del fabbricante, come specificato nel foglietto kit, tranne che i campioni di prova saranno aliquote duplicato di ogni estratto capelli ricostituita invece di campioni di saliva. </li><li> Preparare un estratto dei capelli di controllo di qualità (QC) per l&#39;utilizzo in ogni test. <ol><li> Raccogliere un certo numero di campioni di capelli in più e uno elaborarli singolarmente come nei passi 4.1 e 4.2 o piscina per il campione di trasformazione grandi come nei passi 3.1 e 3.2. </li><li> Far evaporare il solvente e ricostituire gli estratti come nei passi 5.1 e 5.2, quindi unire gli estratti ricostituiti da diversi campioni singoli o aggregati. </li><li> Aliquota un volume adeguato dell&#39;estratto ricostituito pool (ad esempio 0.10 ml) in provette da microcentrifuga individuali e congelare per un uso successivo. </li><li> Scongelare ed eseguire un&#39;aliquota QC in duplice copia su ogni micropiastra immunodosaggio a fornire un referenza valore CORT per il controllo della qualità di ogni esecuzione. </li><li> Un coefficiente intra-saggio di variazione (CV, definita come la deviazione standard divisa per la media di un insieme di valori di esempio) può essere calcolato analizzando 10-12 QC pozzetti nello stesso periodo, mentre un inter-saggio CV può essere calcolato utilizzando i valori QC attraverso un gruppo di piste. Se il proprio software lettore di micropiastre calcola un CV per i pozzetti duplicati rappresentano ogni estratto di capelli, quindi un metodo alternativo per la determinazione intra-assay CV è quello di calcolare la media di tali valori individuali CV su tutta la piastra. </li><li> Se un estratto del campione produce una lettura superiore al più alto standard CORT nella VIA, poi un&#39;altra aliquota dell&#39;estratto viene diluita con una quantità appropriata di tampone e la successiva lettura VIA viene corretto per il fattore di diluizione. I campioni vengono inoltre regolarmente rianalizzati se il CV per i pozzetti duplicati è&gt; 10%. </li><li> Perché kit CORT EIA sono progettati per misurare CORT values in campioni liquidi come saliva o plasma, l&#39;uscita del software lettore di micropiastre deve essere convertito in quantità di CORT per unità di peso di capelli in polvere. La seguente formula converte l&#39;uscita dosaggio in mg / dl a pg CORT per capelli mg: (A / B) * (C / D) * E * 10.000 = F dove A = mg / dl uscita dal dosaggio; B = peso (in mg) di capelli sottoposto ad estrazione; C = vol. (In ml) di metanolo aggiunto ai capelli in polvere; D = vol. (In ml) di metanolo recuperato dall&#39;estratto e successivamente essiccato giù; E = vol. (In ml) di tampone usato per ricostituire l&#39;estratto secco e F = Valore finale della concentrazione di CORT capelli in pg / mg. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Immun. 26, 1019-1029 (2012).</li><li>Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cortisol,+stress+exposure,+and+mental+health+in+humans:+A+systematic+review.">Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review.</a> Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

La procedura capelli CORT sopra descritto è semplice da eseguire, è relativamente poco costoso, fa uso di prodotti chimici facilmente disponibili, reagenti e materiali di consumo, e richiede attrezzature che, con una sola eccezione, è probabile che sia presente in un tipico laboratorio di analisi. L&#39;eccezione è un apparecchio di macinazione come un mulino a sfere o mini-beadbeater. Notiamo che alcuni gruppi di ricerca tritare campioni di capelli in piccoli frammenti di circa 1 millimetro di lunghezza 12,</s...

Misurazione di CORT nel plasma, saliva, o occasionalmente in urina o feci è stato usato come indice di stress fisiologico Dalla scoperta di Selye del ruolo dell&#39;asse HPA stress 1. Sebbene numerosi articoli sono stati pubblicati relative attività HPA a situazioni di stress acuto, il campo è stato ostacolato dalla mancanza di un indice semplice e affidabile di stress fisiologico cronico. Questo problema si verifica perché al plasma e saliva sia resa &quot;punto&quot; stime di attività HPA che sono soggette a variazione circadiana e possono essere confusi da disturbi ambientali. Campioni urinari e fecali producono misure di CORT e / o metaboliti che si estendono su un numero di ore fino ad un giorno intero in alcuni casi. Raccolta di campioni multipli utilizzando una delle seguenti matrici possono fornire un indice grezzo composito di livelli CORT nel tempo, tuttavia, nessuno di questi approcci fornisce un indice veramente a lungo termine di attività HPA e la reattività di questa systaminali a fattori di stress cronico. Misurazione CORT nei capelli ha iniziato ad occupare questa esigenza importante nella letteratura stress. Gli studi iniziali di diversi laboratori hanno dimostrato la presenza di CORT in capelli umani, ma non ha verificato se i livelli di capelli CORT modificate in funzione di stress 2. Come il nostro laboratorio è stato interessato per molti anni nella regolazione dell&#39;asse HPA scimmia rhesus da vari fattori sociali e comportamentali 3, abbiamo deciso di stabilire e convalidare metodi per l&#39;estrazione e l&#39;analisi di scimmia rhesus capelli 4. Basato sulla premessa che CORT ematica viene lentamente e continuamente incorporato in crescita dei capelli, lo scopo di questo nuovo metodo è stato quello di utilizzare livelli di CORT-capelli derivato come indice integrato di attività HPA su periodi di settimane o mesi. Diverse sfide metodologiche sono state incontrate nello sviluppo del presente protocollo. Primo, studi precedenti avevano dimostrato che piccole quantità of circolante CORT sono escreti nel sudore e sebo e quindi potrebbe rivestire l&#39;esterno del fusto del capello 2. Al fine di eliminare questo potenziale confondere, abbiamo sviluppato un procedimento di lavaggio delicato che appare per rimuovere CORT esterno pur avendo un effetto minimo sulla CORT presente all&#39;interno del fusto del capello crescente. Così, capelli scimmia sottoposti a questa procedura (cioè due 3-min lavaggi con isopropanolo) perso circa il 7-8% del contenuto totale di capelli CORT, ed un terzo lavaggio rimosso meno dell&#39;1% più steroideo del campione 4. Sembra che ci sia più CORT esterno in capelli umani, dal momento che la stessa procedura rimossa una media di contenuti CORT totale il 27% dei campioni (K. Rosenberg e J. Meyer, non pubblicati). Come capelli scimmia, tuttavia, un lavaggio supplementare conteneva molto meno CORT (circa 7%) rispetto ai primi due lavaggi. Pertanto, i risultati di entrambi scimmia e capelli umani supportano la tesi che la maggior parte (se non tutti) CORT esterno può essere rimosso, pur mantenendo una grande frazionezione CORT all&#39;interno della matrice interna del capello. In secondo luogo, i nostri studi pilota hanno inoltre dimostrato che la macinazione capelli prima dell&#39;estrazione significativamente maggiore recupero CORT dal campione, presumibilmente rompendo aperto matrice proteica complessa del fusto del capello oltre ad aumentare la superficie disponibile per la penetrazione del solvente. Sono stati sviluppati due diversi metodi di rettifica, ognuna con vantaggi e svantaggi. Metodo 1, che utilizza un mulino a sfere, ha il vantaggio di produrre la polvere più fine. Tuttavia, un mulino a sfere è un elemento dell&#39;impianto relativamente costoso e, se utilizzato con giare standard e palle, è in grado di macinare solo due campioni per volta. Piccoli campioni sono anche difficili da trattare utilizzando un mulino a palle con giare standard. Metodo 2, che utilizza un beadbeater, è meno efficace nella sua capacità di macinazione. Come risultato, recupero medio CORT inferiore di circa il 10% utilizzando questo metodo rispetto al mulino a sfere (dati non pubblicati). D&#39;altra parte, un beadbeaterè considerevolmente meno costoso di un mulino a palle, 16-24 campioni possono essere macinati contemporaneamente a seconda del modello, e il metodo è adatto per piccoli campioni. A causa del recupero differenziale suddetto, è consigliabile utilizzare lo stesso metodo di macinazione per tutti i campioni all&#39;interno di un particolare studio. Una volta che i campioni di capelli sono stati elaborati, vengono estratti con metanolo e CORT negli estratti viene analizzato mediante un kit EIA commerciale sensibile e specifico originariamente progettato per misurare CORT salivare. Le procedure di estrazione e di analisi sono stati convalidati in parte dimostrando che diluizioni seriali di estratti di campioni di capelli scimmia ha prodotto letture EIA che strettamente parallela alla letture ottenute dagli standard CORT autentici. Abbiamo poi dimostrato che CORT capelli (in aggiunta al plasma e salivare CORT) era sensibile alla importante fattore di stress vita di un trasferimento amministrativo incaricato delle scimmie a nuovi quartieri abitativi 4,5. La presentazionecarta t fornisce un resoconto dettagliato dei metodi utilizzati di routine nel nostro laboratorio per elaborare campioni di capelli umani e scimmie e per estrarre e analizzare CORT da tali campioni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade isopropanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A451</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade methanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Salivary cortisol assay kits</td>
			<td style="width:116px;">Salimetrics</td>
			<td style="width:119px;">1-3002</td>
			<td>See manufacturer&#39;s kit insert for information on assay sensitivity and specificity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Max Scientific</td>
			<td>10-9151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.0-ml XXTuff reinforced microvials</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>330TX</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.2-mm chrome-steel beads</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>11079132c</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10-ml stainless steel grinding jars</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">02.462.0061</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-mm stainless steel grinding balls</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">05.368.0037</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant activated carbon cartridge</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DTK120R</td>
			<td>Use with Savant chemical trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for 15-ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>S02135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>NC9854190&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MM 200 mixer mill</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Beadbeater 16&#160;</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant DNA Speedvac</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DNA120-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant refrigerated vapor trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>RVT400-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant chemical trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>SCT120</td>
			<td>Alternative to refrigerated vapor trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate washer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate mixer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Multichannel pipetter</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair

Il cortisolo, ormone dello stress (CORT) sta lentamente incorporato nel fusto del capello crescente di esseri umani, primati non umani, e altri mammiferi. Abbiamo sviluppato e validato un metodo per l&#39;estrazione e l&#39;analisi CORT da capelli scimmia rhesus e successivamente adattato questo metodo per l&#39;utilizzo con i capelli del cuoio capelluto umano. In contrasto CORT &quot;campioni point&quot; ottenuti dal plasma o saliva, capelli CORT fornisce una misura integrata di attività del sistema ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA), e quindi lo stress fisiologico, durante il periodo di ormone incorporazione. Perché i capelli del cuoio capelluto umano cresce ad un tasso medio di 1 cm / mese, i livelli di CORT ottenuti dai segmenti di capelli diversi cm di lunghezza possono potenzialmente servire come biomarcatore di stress sperimentato un certo numero di mesi. Nel nostro metodo, ciascun campione di capelli viene prima lavato due volte in isopropanolo per rimuovere eventuali CORT dall&#39;esterno del fusto del capello che è stato depositato dal sudore o sebo. Dopo l&#39;essiccazione, lacampione viene macinato in polvere finissima per rompere matrice proteica del capello e aumentare la superficie per l&#39;estrazione. CORT dall&#39;interno del fusto del capello è estratto in metanolo, il metanolo viene evaporato, e l&#39;estratto viene ricostituito in tampone di saggio. Estratto CORT, con norme e controlli di qualità, viene poi analizzato mediante un enzima disponibile in commercio immunodosaggio sensibile e specifico (EIA) kit. Lettura della VIA viene convertito in pg CORT per mg peso dei capelli in polvere. Questo metodo è stato utilizzato nel nostro laboratorio per analizzare i capelli CORT negli esseri umani, diverse specie di macachi, uistitì, cani e orsi polari. Molti studi sia dal nostro laboratorio e da altri gruppi di ricerca hanno dimostrato la vasta applicabilità di capelli CORT per la valutazione dell&#39;esposizione stress cronico in naturale così come le impostazioni di laboratorio.

La Figura 1 mostra la stampa da una serie rappresentativa di campioni di capelli umani (maschi adulti e soggetti umani femmine) trattati con il metodo 2 macinazione ed estrazione. Il software è stato utilizzato per generare l&#39;uscita dei dati e per adattarsi a 4 parametri curva sigmoidale agli standard CORT (Figura 2). I tra-ben CV di questa piastra variava 0,01-5,73%, con una media di CV intra-saggio del 1,34%. Il CV inter-assay determinato utilizzando i valori di QC da nove recent...

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Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Cortisolo (CORT) si accumula nel fusto del pelo crescente di esseri umani e primati non umani. Descriviamo metodi per l&#39;estrazione e l&#39;analisi dei capelli CORT con alta precisione e sensibilità. Misura di capelli CORT è particolarmente adatto per la valutazione dello stress cronico per periodi di settimane o mesi.

Estrazione e analisi di cortisolo da umani e Monkey Capelli

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

28.1K Views.  University of Massachusetts, Amherst.  Cortisolo (CORT) si accumula nel fusto del pelo crescente di esseri umani e primati non umani. Descriviamo metodi per l'estrazione e l'analisi dei capelli CORT con alta precisione e sensibilità. Misura di capelli CORT è particolarmente adatto per la valutazione dello stress cronico per periodi di settimane o mesi. 

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Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Ricerca

Biologia

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandina estrazione e l&#39;analisi in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

Estrazione di Venom Venom e Gland Microdissections da Spiders per proteomica e analisi trascrittomica

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Una nuova tecnica di analisi quantitativa di perdita dei capelli nei topi mediante analisi in scala di grigi

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Flusso di lavoro completo per l&#39;analisi dell&#39;istone modificazioni post-traduzionali Utilizzando Bottom-up Spettrometria di Massa: Da istone estrazione all&#39;analisi dei dati

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

Estrazione della cromatina dal tessuto epatico chimerico congelato per l'analisi dell'immunoprecipitazione della cromatina

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

Raccolta dei tessuti ed estrazione dell'RNA dall'articolazione del ginocchio osteoartritico umano

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary but also across multiple points of control within the hypothalamic/pituitary/ovarian circuit. Within the ovary, multiple specialized cell types grow in close association with the oocyte within the ovarian follicles. The biology of these cells has been well described at the later stages, when they are easily recovered as byproducts of assisted reproductive treatments. However, the in-depth analysis of small antral follicles isolated directly from the ovary is not commonly carried out due to the scarcity of human ovarian tissue and the limited access to the ovary in patients undergoing assisted reproductive treatments. 
These methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips with the concurrent identification/isolation of ovary resident cells enable the high-resolution analysis of the early stages of antral follicle development. We demonstrate protocols for isolating discrete cell types by treating antral follicles enzymatically and separating the granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells. The isolation of cells from the antral follicles at various sizes and developmental stages enables the comprehensive analysis of the cellular and molecular mechanisms that drive follicle growth and ovarian physiology and provides a source of viable cells that can be cultured in vitro to recapitulate the follicle microenvironment.

Here, we present protocols for the identification and purification of ovarian cells from antral follicles. We elaborate on methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips while also harvesting intact antral follicles that are treated enzymatically to liberate multiple follicle resident cell types, including granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells.

Estrazione, etichettatura e purificazione di cellule specifiche del lignaggio da follicoli antrali umani

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...