Questo è un metodo nuovo per la valutazione dell'ormone glucocorticoide, cortisolo, dalla pelliccia di koala. Fornisce un nuovo biomarcatore per la valutazione dello stress cronico nei koala. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un metodo altamente sensibile e riproducibile con un tempo di consegna abbastanza rapido tra la preparazione del campione e il test ormonale.
Questa tecnica consente la valutazione quantitativa dello stress cronico nei koala, che è uno strumento di gestione clinica altamente utile. Ad aiutarmi con questa procedura c'è Dylan Fox, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura recupera la pelliccia dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius e lasciala scongelare a temperatura ambiente.
Quindi, pesare la pelliccia su un bilanciere analitico di precisione di laboratorio. Posizionare 60 milligrammi di pelliccia in un tubo di centrifuga pre-pesato ed etichettato da 1,5 millilitri e ripeterlo fino a riempire 18 tubi. Utilizzando una pipetta, aggiungere un millilitro di isopropanolo di grado HPLC al 100% a ciascun tubo.
Vortice i campioni per 30 secondi. Filtrare ogni campione con un setaccio micro-precisione da 0,5 millilitri in modo da ottenere la separazione di liquido e pelliccia e scartare il liquido in un contenitore di rifiuti. Posizionare ogni campione di pelliccia in una barca di pesatura in plastica etichettata.
Quindi mettere le barche di pesatura in un essiccatore sottovuoto e lasciare per tre giorni per lasciare asciugare la pelliccia. Una volta che la pelliccia è completamente asciutta, posizionare ogni campione in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri etichettato. Posizionare ogni campione in un mulino perline con tre perline di acciaio cromato e polverizzare per due minuti a 30 scosse al secondo.
Ripetere questo trasferimento con metanolo di grado analitico al 100% e isopropanolo di grado analitico al 100% fino a quando non sono stati riempiti 18 tubi totali. Successivamente, utilizzare una pipetta per trasferire un millilitro della prima tecnica di estrazione in sei tubi di centrifuga da 1,5 millilitri contenenti il campione di pelliccia. Cappucciare ogni tubo e utilizzare uno shaker per incubarli a temperatura ambiente con pulsare costante per almeno 12 ore.
Quindi filtrare i campioni con un setaccio micro-precisione da 0,5 millilitri. Utilizzare una pipetta per trasferire il liquido in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri etichettato, assicurando al contempo che la pelliccia sia scartata in modo appropriato. In una cappa aspirante, provare completamente l'estratto di solvente sotto un flusso di vapore di azoto.
Quindi, ricostituire il campione essiccato con 400 microlitri di tampone di dosaggio e 100 microlitri di etanolo di grado analitico al 100%. Per effettuare i controlli, selezionare prima i campioni di animali con esposizione nota allo stressante. Per realizzare una piscina di estrazione, prendere 20 microlitri di estratto da ciascun campione fino a ottenere un volume totale di 200 microlitri.
Conservare il pool di estrazione a meno 80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'esecuzione dei test. Quando è pronto, ottenere il fattore di diluizione per i punti di legame del 30% e del 70% dal grafico del parallelismo per l'estratto rispetto allo standard del cortisolo e utilizzare il buffer di dosaggio per diluire il pool di campioni in modo appropriato per creare i controlli alti e bassi. Utilizzando un kit di cortisolo commerciale impostare una piastra a nastro da 96 pompoli che includa campioni, controlli, standard di cortisolo, pozzi di rilegatura non specifici e pozzi di legame massimo secondo le istruzioni del fornitore.
Utilizzare il foglio di layout della piastra incluso nel libretto del kit per elencare le posizioni dei campioni, dei controlli e degli standard. Successivamente, seguire il processo di estrazione dell'ormone della pelliccia descritto in precedenza per ottenere una pelliccia di koala estratta al 100% da metanolo. Preparare i reagenti del kit di cortisolo secondo le istruzioni del produttore.
Pipetta 50 microlitri di campioni o standard nei pozzi della piastra. Pipetta 75 microlitri di tampone di dosaggio nei pozzi di legame non specifici e 50 microlitri di tampone di dosaggio nei pozzi di legame massimo. Utilizzando una pipetta ripetitore aggiungere 25 microlitri del cortisolo coniugati ad ogni pozzo.
Quindi, pipettare 25 microlitri dell'anticorpo del cortisolo in ogni pozzo, ad eccezione dei pozzi leganti non specifici. Toccare delicatamente i lati della piastra per assicurarsi che i reagenti siano ben miscelati. Coprire la piastra con il sigillare a piastre e utilizzare uno shaker orbitale per agitare a temperatura ambiente per un'ora.
Dopo questo, rimuovere la guarnizione della piastra e aspirare la piastra del pozzo lavando ogni bene con 300 microlitri di tampone di lavaggio quattro volte. Quindi asciugare il piatto toccandolo su asciugamani assorbenti puliti. Pipetta 100 microlitri di substrato di tetrametilbenzidina ad ogni pozzo.
Posizionare il sigillare piatto sulla piastra del pozzo e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, pipettare 50 microlitri di soluzione di arresto in ogni pozzo. Trasferire la piastra in un lettore di lastre in grado di leggere 450 nanometri e calcolare la concentrazione dell'ormone finale come delineato nel protocollo di testo.
In questo studio, il rilevamento saggio di metaboliti ormonali di interesse è determinato utilizzando il parallelismo. Sulla curva di parallelismo, il punto di associazione del 50% determina il fattore di diluizione del campione sulla curva standard. Come si può vedere, gli estratti di etanolo al 100% e di isopropanolo al 100% non hanno fornito uno spostamento parallelo rispetto allo standard del cortisolo.
Tuttavia, l'estratto di metanolo al 100% fornisce uno spostamento parallelo rispetto allo standard del cortisolo. I coefficienti di variazione intra-e inter-dosaggio sono determinati da estratti di campioni ad alta e bassa legatura eseguiti in tutti i saggi. I controlli interni a bassa associazione sono considerati un pool di estrazione koala pulito, mentre i controlli interni ad alta associazione sono considerati pool di estrazione koala diluito uno-a-due.
L'associazione tra ogni estratto di solvente e lo standard del cortisolo viene quindi determinata utilizzando un grafico di regressione. L'estratto al 100% di metanolo fornisce la migliore linea di regressione con il più alto valore al quadrato R rispetto agli estratti di isopropanolo al 100% e 100%. È importante ricordare che la fase di lavaggio del campione deve essere eseguita prima di macinare i campioni per evitare la perdita di ormoni steroidei.
Seguendo questa procedura, possiamo misurare altri ormoni steroidei, come gli ormoni riproduttivi per guardare le interazioni tra stress e riproduzione nei koala. Questa tecnica fornisce un nuovo strumento per l'emergente campo della fisiologia della conservazione, consentendo la valutazione non invasiva del cortisolo nella pelliccia di koala. Il kit di cortisolo commerciale fornisce reagenti in quantità minima.
Tuttavia, è importante indossare dispositivi di protezione individuale per ridurre al minimo le lesioni a se stessi durante lo svolgimento di questa procedura di laboratorio.
