Questa ricerca è stata finanziata dal premio di USDA-catino 2015-67015-23488 a Roger Cone. Gli autori ringraziano il Dr. Ronald Phelps per la descrizione dei criteri di selezione dei titoli covata nel video. Ahmed Elaswad e Karim Khalil vorrei ringraziare egiziano culturale ed educativo Bureau a Washington DC per finanziare la loro ricerca di dottorato di ricerca.

Questo esperimento è stato condotto presso l'unità di ricerca genetica di pesce, E. W. Shell pesca Research Center, Auburn University, AL. Tutti i protocolli sperimentali utilizzati in questo esperimento sono stati approvati dal comitato di uso (AU-IACUC) e Auburn University istituzionale Animal Care prima che l'esperimento è stato avviato. Un elenco delle attrezzature e rifornimenti usati in questo esperimento può essere trovato nella tabella materiali. Di seguito sono i passaggi e le procedure di preparazione e microiniezione di embrioni di topo pesce gatto della manica come illustrato nella Figura 1.
1. selezione dei titoli e la deposizione delle uova di covata
<ol><li>Scegliere riproduttori sano pesce gatto della manica dal ceppo o linea genetica di interesse. Femmine e maschi di pesce gatto della manica devono presentare buone caratteristiche secondarie del sesso.</li>
	<li>Selezionare i maschi che hanno una vasta testa muscolare che è più ampia rispetto al resto dei loro corpi con papilla genitale ben sviluppato. Colore scuro, cicatrici e ferite da combattimento territoriale sono anche segni di disponibilità sessuale. Selezionare le femmine che hanno le teste che sono più strette rispetto al resto dei loro corpi e avere addome palpabile, morbido e ben arrotondati. Per precisione e per evitare sottolineando il pesce durante la manipolazione iniziale, smettere di nutrire le femmine 2-3 giorni prima di esaminare la loro prontezza per la deposizione delle uova.</li>
	<li>Eseguire pesce movimentazione rapidamente, ma con attenzione. Per ridurre lo stress di movimentazione, eseguire tutte le procedure che richiedono manipolazione femmine mentre si tiene il pesce nella deposizione delle uova borse (maglia di dimensioni 32 mm).</li>
	<li>Appena prima dell'iniezione di ormone per indurre l'ovulazione, misurare il peso del corpo delle femmine.</li>
	<li>Appendere le borse di deposizione delle uova con le femmine all'interno in un flusso mediante serbatoio con flusso d'acqua continuo e un'adeguata aerazione.</li>
	<li>Asetticamente, caricare l'iniettore per impianto che ha un ago di 14 G con 85 µ g/kg dell'impianto (LHRHa) analogico di ormone di rilascio dell'ormone luteinizzante. Sciacquare il sito di iniezione (muscolatura dorsale) con 0,9% soluzione salina sterile prima dell'iniezione. Inserire l'iniettore per impianto ad un angolo di 45° e rilasciare l'impianto. Ritirare l'ago e scorri il sito di iniezione con un batuffolo di cotone imbevuto precedentemente in etanolo al 70%.</li>
	<li>Mettere il sacchetto di deposizione delle uova nel serbatoio di modo che il pesce sia completamente immersa nell'acqua 15-20 cm sotto la superficie dell'acqua. Adeguata aerazione (sopra 5 ppm dissolto ossigeno) e la buona qualità dell'acqua sono importanti per l'ovulazione di uova di alta qualità.</li>
	<li>Prevedere il tempo di ovulazione in base alla temperatura dell'acqua utilizzando il rapporto di grado-ora (h)35. Tempo di risposta di gradi-h = tempo tra iniezione di ormone e l'ovulazione (h) * temperatura (° C) dell'acqua. Ad esempio, per un tempo di risposta di gradi-h 900-1000, una donna è previsto per deporre le uova a 36-40 h da tempo di iniezione di ormone a 25 ° C. Di solito, il primo controllo per uova avviene a circa 36 h dopo l'iniezione di ormone e quindi all'intervallo di 4 ore.</li>
	<li>Per controllare l'ovulazione, sollevare delicatamente il sacchetto di deposizione delle uova sopra la superficie dell'acqua mentre si sta cercando per le uova che sono attaccate all'interno del sacchetto di deposizione delle uova. Vedere almeno 10 uova indica che questa femmina è ovulating e pronto per mano di spogliatura.</li>
</ol>2. sperma preparazione
Nota: Lo sperma può essere preparato qualche h prima dell'orario previsto dell'ovulazione.
<ol><li>Eutanasia maschi da un colpo di percussione alla testa senza anestesia, dal momento che l'anestesia potrebbe avere un effetto negativo sulla motilità dello sperma.</li>
	<li>Raccogliere i testicoli in un piccolo piatto di pesata, rimuovere qualsiasi tessuto e lavarli con 50 mL di soluzione fisiologica allo 0,9% per rimuovere il sangue, se necessario. Testicoli ben sviluppati sono bianchi con molte proiezioni villiformi ( Figura 2).</li>
	<li>Determinare il peso dei testicoli.</li>
	<li>Per preparare la soluzione di spermatozoi per la fecondazione dell'uovo, è possibile trasferire i testicoli al centro di una mesh di µm2 100 100 cm usando il forcipe. Piegare la mesh con i testicoli all'interno, schiacciare i testicoli e filtrare lo sperma in una provetta di raccolta di 50 mL. Questo può essere fatto applicando pressione ai testicoli all'interno della mesh contro il bordo del tubo di raccolta tramite il pollice. Utilizzare soluzione fisiologica 0,9% per lavare lo sperma dalla mesh nella provetta di raccolta. Soluzione salina possa essere aggiunti fino a 10 mL/g di testicoli.</li>
	<li>Determinare la concentrazione degli spermatozoi, controllare la motilità e vitalità. Nota: La concentrazione può essere determinata contando gli spermatozoi in un volume noto di diluito di milt utilizzando un emocitometro. In alternativa, si può stimare la densità dello sperma valutando la densità ottica di milt utilizzando uno spettrofotometro. In questo metodo, l'assorbimento a 505 nm viene confrontato con un grafico di controllo che è stato precedentemente preparato per l'assorbimento delle concentrazioni differenti di sperma36. Motilità degli spermatozoi può essere verificata sotto il microscopio come il tempo da attivazione dello sperma fino alla cessazione di sperma movimento (denominato durata di motilità)37. La vitalità degli spermatozoi può essere determinata dalla macchiatura lo sperma con coloranti selettivi quali trypan blu, che si macchia solo non vitali delle cellule dello sperma, mentre spermatozoi vitali rimarrà senza macchia. Tuttavia, per queste procedure di microiniezione, questo non è necessario se i testicoli sono ben sviluppati.</li>
	<li>Immagazzinare lo sperma in soluzione fisiologica 0,9% da passo 2,5 a 4 ° C e utilizzare entro 24 ore dopo la preparazione.</li>
</ol>3. raccolta e fecondazione di uova
<ol><li>Applicare uno strato molto sottile di grasso ad un diametro di 20 cm pulito e asciutto la deposizione delle uova pan vegetale.</li>
	<li>Inserire la femmina nella soluzione anestetica contenenti 100 ppm di solfonato di metano di tricaina tamponata con bicarbonato di sodio (pH della soluzione finale dovrebbe essere 7.0) fino a quando il pesce è completamente anestetizzato38. Attenzione: Tricaina solfonato di metano può essere irritante se inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle.</li>
	<li>Con attenzione, rimuovere il pesce dal sacchetto di deposizione delle uova e immergerlo nella soluzione fisiologica 0,9% per lavare via la soluzione anestetica. Asciugare il pesce completamente utilizzando un asciugamano pulito, evitando la rimozione dello strato di muco sulla superficie del corpo di pesce.</li>
	<li>Applicare grasso vegetale per l'area attorno alla bocca, comprese le pinne pelviche, per impedire il collegamento delle uova durante mano stripping.</li>
	<li>Mano della striscia le uova nella padella unta riproduttiva applicando pressione delicata alle ovaie. Buone uova dovrebbero fluire liberamente, essere di colore giallo oro e avere minime o nessun ciuffi o coaguli di sangue (Figura 2). Evitare il contatto tra uova e acqua prima della fecondazione, come acqua in grado di stimolare chiusura micropilo.</li>
	<li>Per fecondare le uova per il microinjection, trasferire 200-300 uova per una teglia unta di deposizione delle uova. Etichette per piante plastica unta utilizzabile come un cucchiaio per trasferire le uova nella padella unta di deposizione delle uova. Aggiungere 1 – 2 mL della soluzione di sperma (dal punto 2.5) alle uova e mescolare delicatamente. Il rapporto di sperma all'uovo dovrebbe essere circa 11.000 sperma/uovo.</li>
	<li>Aggiungere acqua dolce alle uova per attivare lo sperma e uova. Aggiungere acqua sufficiente a coprire leggermente le uova. Agitare delicatamente le uova per 30 s. fecondazione deve avvenire in 1 – 2 min. È importante fertilizzare le uova che sono organizzate in un unico strato. Uova di pesce gatto aderiscono a vicenda rendendo difficile microinject strati multipli di embrioni.</li>
	<li>Aggiungere più acqua dolce per le uova fecondate e le uova indurire per 10 – 15 min.</li>
	<li>Coprire il tegame di deposizione delle uova contenenti le rimanenti uova non fecondate in un asciugamano bagnato per evitare l'essiccazione e fertilizzare sopra un paio d'ore. La fecondazione può essere fatto in modo sfalsato, ad esempio, un lotto di 200 – 300 uova possono essere fertilizzato ogni 30-60 min per garantire un approvvigionamento continuo di embrioni allo stadio di una cellula microiniezione ed embrioni di controllo non-iniettato. Evitare il contatto tra l'asciugamano bagnato e le uova come le uova possono aderire all'asciugamano bagnato, rendendo difficile per rimuoverli. In questo protocollo, uova fecondate all'interno di 2 – 3 h dopo stripping sono stata microiniettate in modo efficiente e aveva un successo simile come uova fecondate immediatamente dopo stripping.</li>
</ol>4. ago tirando e caricamento
<ol><li>Tirare un vetro borosilicato di 1,0 mm OD capillare in 2 aghi (Figura 3). Conservare gli aghi in una scatola di carta con un pezzo di spugna in cui sono state apportate diverse incisioni. Per evitare di rompere l'ago, il diametro della spugna dovrebbe essere minore della lunghezza dello stelo dell'ago.</li>
	<li>Aprire la punta dell'ago rompendo un piccolo pezzo di regione più sottile dell'ago con un oggetto appuntito. In alternativa, è possibile aprire l'ago da pizzicamento fuori della regione più sottile della punta con il forcipe sotto il microscopio.</li>
	<li>Preparare la soluzione di iniezione con gRNA(s) con Cas9 proteina. Altri tipi di RNA o la proteina possono anche essere iniettati con la stessa procedura. In questo protocollo, gRNAs sono stati progettati per destinazione due dei channel catfish geni correlati immuni, pedaggio/interleukin 1 dominio contenenti adattatore molecola (TICAM1) del gene del recettore e ramnosio binding lectin (RBL) gene e preparati secondo Shah et al. con l'uso di un'alta fedeltà Taq polimerasi32,39. Il target genomici per gRNAs erano 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' per TICAM 1 gene (Figura 4) e 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' per sequenza dell'esone 1 del gene RBL con protospacer adiacente motivo (PAM) sottolineato (Figura 6).<ol>
<li>Gli obiettivi di scoppio guida RNA contro il genoma di pesce gatto della manica di sequenza e selezionare quelli senza potenziali siti fuori bersaglio.</li>
		<li>Aggiungere rosso fenolo al colore la proteina gRNA/Cas9 mescolare a un terzo del volume totale.</li>
		<li>Regolare la concentrazione finale della miscela di proteine gRNA/Cas9 con acqua gratuita nucleasi, in modo che ogni embrione viene iniettato con 50 nL contenente circa 2,5 ng gRNA e 7,5 ng Cas9 proteina. Incubare la miscela per 10 minuti in ghiaccio prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Con un microloader, caricare 5-10 µ l della miscela gRNA/Cas9 nell'ago per iniezione inserendo il microloader nello stelo dell'ago ed espellendo la miscela lentamente durante il riavvolgimento la punta di microloader (Figura 3). Evitare di intrappolare bolle d'aria all'interno.</li>
	<li>Inserire l'ago al titolare della micropipetta e garantire un collegamento stretto e quindi fissare il supporto per il micromanipolatore. Garantire la libera circolazione stabile. Applicare pressione per il microinjection aprendo la bombola di azoto e il regolatore di pressione di regolazione. Nota: Il volume di iniezione può essere influenzato dalla pressione, diametro dell'apertura dell'ago e la durata dell'iniezione. Per determinare il volume da iniettare, iniettare una goccia di olio minerale, collocato su un emocitometro. Se necessario, la pressione, la durata dell'iniezione e diametro dell'ago può essere regolata per aumentare o diminuire il volume dell'iniezione. Iniettare più volte l'olio minerale per garantire volume costante.</li>
</ol>5. microiniezione di embrioni di pesce gatto
<ol><li>Applicare uno strato molto sottile di grasso per una capsula di Petri pulita 100mm vegetale.</li>
	<li>Di un'etichetta di plastica unta della pianta, trasferire 50 – 100 uova dalla padella fertilizzazione di Petri e coprirli con la soluzione di Holtfreter (materiali tavolo). Allineare le uova contro l'altro in un unico strato. Questo allineamento dovrebbe tenere le uova in posizione durante il processo di microiniezione.</li>
	<li>Porre la capsula di Petri con le uova sul palco del microscopio e tenerlo con una mano. Abbassare l'ago con l'altra mano (Figura 3) fino a quando perfora il corion e il tuorlo in un unico movimento fluido. La punta dell'ago dovrebbe essere più vicina possibile per il blastodisc prima di consegnare il materiale di iniezione.<ol>
<li>Premere il pedale per consegnare il materiale di iniezione nel tuorlo. Se il blastodisc non è chiaramente visibile, il materiale di iniezione può essere diffusa in diverse posizioni nel tuorlo. A tale scopo, l'ago è inserito all'estremità lontana del tuorlo, quindi premendo il pedale e ritirare l'ago è fatto simultaneamente per diffondere il materiale di iniezione attraverso diverse aree del tuorlo. Fino a 50 nanolitri può essere iniettato il tuorlo di pesce gatto della manica embrioni, tuttavia, la quantità di proteina gRNA/Cas9 deve essere ottimizzato per ogni gene ottenere i migliori risultati per mutazione tasso ed embrione sopravvivenza32.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ritirare l'ago senza intoppi per non danneggiare l'uovo. Spostare il piatto di Petri per iniettare un altro uovo con la stessa procedura. Evitare movimenti di Petri durante il processo di iniezione, poiché questo potrebbe danneggiare l'uovo o rompere l'ago. Rimuovere le uova che sono rotti o danneggiate a causa di microiniezione. L'iniezione può essere avviato a 15 – 20 min dopo la fecondazione e continuare fintanto che gli embrioni sono ancora in fase di una cella (fino a circa 60-90 minuti dopo la fecondazione).</li>
	<li>Posizionare gli embrioni iniettati torna in soluzione di Holtfreter con 10 ppm di doxiciclina e aerazione continua delicata per 6 – 7 giorni fino alla schiusa40. Cambiare la soluzione quotidiana e rimuovere embrioni morti.</li>
</ol>6. rilevazione di mutazione
<ol><li>Casualmente, raccogliere diversi embrioni iniettati al momento della fecondazione post 72 h, rimuovere il tuorlo ed estrarre il DNA genomico. Comprendono 3 – 5 embrioni non iniettato come un controllo. Nota: Il DNA di Genomic possa essere estratte dagli embrioni dopo la rimozione di gusci d'uovo e tuorlo materiale utilizzando la digestione della proteinasi K ed etanolo precipitazioni32.</li>
	<li>Amplificare un segmento di DNA che fiancheggiano il target genomici per gRNA di ogni gene, dove le mutazioni si pensano che accadano, utilizzando un'alta fedeltà Taq polimerasi32. Per TICAM 1, i primer 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (avanti) e 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (inverso) sono stati utilizzati per amplificare un 750 bp mentre per RBL, i primer 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (avanti) e 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (inverso) sono stati utilizzati per amplificare un segmento di bp 375 dal gene RBL.<ol>
<li>Utilizzare la seguente reazione di PCR: fino a 20 µ l PCR grade acqua; 1 x ad alta fedeltà tampone di reazione enzima Taq con MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 0,4 µM per ciascuno del primer forward e reverse lo stesso set, 100-300 ng DNA genomico e 1,25 unità di alta fedeltà Taq enzima blend. Eseguire in bicicletta di PCR: denaturazione iniziale a 94 ° C per 3 min; 35 cicli di denaturazione a 94 ° C per 30 s, ricottura a 60 ° C per 55 s per TICAM e 40 s per RBL, estensione a 72 ° C per 1 min/kb; ed estensione finale a 72 ° C per 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rilevare gli embrioni mutanti utilizzando un metodo di rilevazione di mutazione come il sequenziamento dei prodotti di PCR purificati, analisi di rilevazione di mutazione di surveyor, analisi di mobilità dell'eteroduplex, perdita di luogo di riconoscimento degli enzimi di limitazione, o qualsiasi altro metodo di rilevazione di mutazione è appropriato per il target. In questo protocollo, rilevare embrioni mutanti usando analisi di rilevazione di mutazione di surveyor per TICAM 1 e perdita dell'enzima di restrizione che SAPI tagliare sito così come ordinamento dei prodotti PCR purificati per gene RBL.</li>
	<li>Per identificare gli alleli del mutante, clonare i prodotti di PCR e vettori di sequenza da diverse colonie. Gli alleli del mutante ha presentati in Figura 4 e Figura 6 è venuto da embrioni iniettati. I prodotti di PCR da sei microiniettati ed embrioni di controllo 3 per ogni gene sono stati riuniti in due tubi separati, uno per gli embrioni iniettati e l'altro per gli embrioni di controllo, rapidamente clonati e 86 vettori per TICAM 1 e 48 vettori per gene RBL sequenziato, tra cui 8 sequenziamento reazioni da 3 embrioni di non-iniettato di controllo per ciascun gene.</li>
	<li>Per identificare alleli differenti del mutante, confrontare le sequenze da embrioni mutanti alla sequenza wild-type utilizzando qualsiasi strumento di allineamento di sequenza di DNA come BLAST o T-caffè.</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

È stato presentato un protocollo dettagliato per il microinjection di embrioni di pesce gatto della manica per raggiungere knockout del gene. Iniezione di proteine CRISPR/Cas9 nel tuorlo è molto più semplice, consente di risparmiare tempo e non richiede una formazione ampia rispetto ai microinjecting il blastodisc dell'embrione un cella, che è la tecnica più comune per la maggior parte di trasferimento genico e gene editing con pesce 30 , 42. il protocollo a...

Microiniezione è una comune tecnica di laboratorio utilizzata per distribuire una piccola quantità di una sostanza come DNA, RNA, proteine e altre macromolecole nelle cellule o embrioni attraverso un capillare di vetro1. Microiniezione viene eseguita utilizzando l'installazione di attrezzature speciali tra cui un microinjector, micromanipolatore e un microscopio2. La tecnica è stata utilizzata dai ricercatori per modificare geneticamente molti organismi attraverso la generazione di transgenetica, TNA knockouts genica e la terapia genica, con l'obiettivo di comprendere le dinamiche di componenti intracellulari3,4 , 5.
Il pesce gatto della manica (Ictalurus punctatus) è la specie di pesce gatto più popolare nel settore dell'acquacoltura e attività di pesca sportiva negli Stati Uniti. C'è un crescente bisogno di studiare la genomica funzionale in pesce gatto della manica, e sequenziamento del genoma completo di pesce gatto della manica migliora l'utilità degli avanzamenti recenti nel genoma editing strumenti6,7. Comprendere la funzione del gene non sarebbe solo arricchire la ricerca che viene condotta sul pesce gatto, ma potrebbe anche portare a programmi di miglioramento genetico più efficaci per migliorare l'industria del pesce gatto. Una volta identificati geni critici per un determinato tratto di interesse, sono utilizzabili per migliorare geneticamente la produzione di pesce gatto attraverso l'editing genomico per generare benefici alleli, selezione di questi alleli, sopprimendo gli alleli dannosi, trasferimento gli alleli benefici attraverso la transgenesi, o qualche combinazione di queste opzioni. Combinando i migliori geni per diversi tratti commercialmente vantaggioso da specie diverse in un pesce notevolmente migliorare la produttività e la redditività di pesce produzione operazioni8.
Gene knockout è un metodo diretto per studiare il gene funzioni in vivo. Mutazioni a livello del DNA verranno ereditate dalle generazioni future che faciliteranno lo studio dei loro effetti in diverse generazioni. Strumenti di editing di genoma differenti sono state sviluppate compreso zinco nucleasi a dita (ZFNs), trascrizione nucleasi attivatore-come effettore (TALENs) e cluster regolarmente interspaziata breve palindromica ripetizioni/CRISPR-associati proteina 9 (CRISPR/Cas9 ) sistema9,10,11,12.
Il sistema CRISPR/Cas9 è uno strumento potente, efficiente che è stato utilizzato per modificare le sequenze di DNA genomic compreso knockout del gene nei pesci attraverso RNA-guida site-specific DNA cleavage5,13. Il sistema è costituito da un RNA di guida (gRNA), che determina la sequenza mirata nel genoma e un enzima di endonucleasi di DNA, Cas9. Il sistema CRISPR/Cas9 può essere progettato per indirizzare qualsiasi sequenza del genoma con parecchi vantaggi sopra ZFNs e TALENs: (1) abbassare costo (2) più facile di ingegneria (3) più specifica associazione di guida RNA nella sequenza di destinazione e ridotto le mutazioni fuori bersaglio (4) sequenze multiple possono essere mirate con gRNA differente allo stesso tasso di alta mutagenesi di tempo (5) in geni che potrebbero non essere mutato dalla TALENs e (6) Tasso di trasmissione di germline migliorata delle mutazioni per fino a 6 volte rispetto al ZFNs e TALENs14, 15,16,17,18.
Il principale metodo alternativo per il microinjection è elettroporazione, in cui gli impulsi elettrici vengono applicati per gli embrioni o cellule per aumentare la permeabilità della membrana e l'assorbimento di molecole biologiche19,20. Parecchi pesci transgenici sono stati generati usando elettroporazione come medaka (Oryzias latipes), zebrafish (Danio rerio), chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha), pesce gatto della manica, orata (Sparus sarba), e comuni della carpa (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.
L'elettroporazione è stato utilizzato per fornire il plasmide DNA, RNA e Cas9 proteine per knockout del gene. In cellule di mammifero, Cas9/gRNA plasmide DNA, mRNA Cas9/gRNA e complessi proteina/gRNA Cas9 sono stati consegnati usando elettroporazione e i tassi di mutagenesi erano più alti utilizzando complessi proteina/gRNA Cas9 per la maggior parte elettroporazione condizioni testate27. Cordato le Ascidie (Ciona intestinalis), TALENs esprimendo costrutti erano individulamente in uova fecondate per indurre ad eliminazione diretta di più geni28. ZFNs esprimendo plasmide costrutti sono state elettroporate a knock out ormone luteinizzante in pesce gatto della manica29. Tuttavia, una volta introdotto nella cellula, costrutti di plasmide saranno necessario essere trascritti di RNA e convertita in proteine funzionali prima di essi puoi indirizzare la sequenza di DNA desiderata, che sarebbe probabilmente ritardare il tempo di mutagenesi rispetto alla microiniezione di RNA / proteina. Come è lo sviluppo di un embrione, mutagenesi in ritardo aumenta il mosaicism dei fondatori iniettati. Inoltre, espressione transgenica è improbabile per raggiungere il livello di espressione possibile con microiniezione, abbassando l'efficienza di mutagenesi.
Come un mezzo per l'introduzione di strumenti di editing del genoma nelle cellule, microinjection presenta parecchi vantaggi sopra l'elettroporazione. Genoma molecole di editing può essere introdotto in modo affidabile nelle cellule o embrioni attraverso microiniezioni30. Meno materiale di iniezione è necessario. È facile determinare la quantità di materiale iniettato. Mutazione più elevati tassi di mosaicismo basso nel pesce fondatore possono essere raggiunto che migliorerebbe la trasmissione nella linea germinale di mutazioni di F1. Meno pesce fondatore devono essere analizzati per produrre la prima generazione, a causa del più alto tasso di mutazione. In elettroporazione, più pesce fondatore devono essere analizzati che aumenteranno i costi. Tuttavia, la sopravvivenza degli embrioni microiniettati pesce gatto della manica è inferiore a individulamente quelli, anche se questo può essere superato iniettando più embrioni31,32. In pesce gatto della manica, la sopravvivenza degli embrioni microiniettati tuorlo ha variato da 16 a 55%, secondo i geni presi di mira e il dosaggio della proteina gRNA/Cas932.
Microiniezione regolari degli embrioni di pesce gatto è tecnicamente impegnativo e richiede tempo, tuttavia, un protocollo di microinjection di proteine CRISPR/Cas9 rapido ed efficiente è presentato per gli embrioni di pesce gatto della manica. Questo protocollo richiede meno tempo e competenze, poiché la soluzione della proteina CRISPR/Cas9 viene iniettata il tuorlo di embrioni di una cella. Centinaia di uova fecondate possa essere iniettati in 1h (circa il tempo necessario per la divisione delle cellule prima che si verifichi). Per convalidare il protocollo, due geni correlati alla suscettibilità di malattia sono stati eliminati in pesce gatto della manica, il pedaggio/interleukin 1 dominio contenenti adattatore molecola (TICAM1) del gene del ricevitore e del gene di ramnosio binding lectin (RBL). TICAM 1 è coinvolto nella via di segnalazione avviata dal recettore toll-like (TLR) 3. In pesce gatto della manica, TICAM 1 era drammaticamente sovraregolati dopo sfida batterica con Edwardsiella ictaluri, mentre era downregulated in pesce gatto blu, una specie resistente al ictaluri E.33. RBL svolge un ruolo importante nell'infezione iniziale con Flavobacterium columnare, l'agente eziologico della malattia columnaris, dove acuta e upregulation robusto è stato registrato in un ceppo di pesce gatto della manica columnaris-suscettibili rispetto ad un ceppo resistente columnaris34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:136px;">Reproboost implant</td>
			<td style="width:115px;">Center of Marine Biotechnology</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">TRICAINE-S</td>
			<td style="width:115px;">Western Chemical. Inc.</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:136px;">Phenol red</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">P0290</td>
			<td style="width:171px;">0.5%, sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;">213709</td>
			<td style="width:171px;">For visualizing the eggs during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Microinjector</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MPPI-3</td>
			<td style="width:171px;">For the delivery of the injection material into the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MM33&#160;</td>
			<td style="width:171px;">For holding and controlling the movement of the injection needle.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Eppendorf Microloader</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">5242956.003</td>
			<td style="width:171px;">For loading injection solution into microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:136px;">Vertical needle puller</td>
			<td style="width:115px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:99px;">Model 720</td>
			<td style="width:171px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Cas9 protein</td>
			<td style="width:115px;">PNA Bio Inc.&#160;</td>
			<td style="width:99px;">CP01</td>
			<td style="width:171px;">Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Expand High FidelityPLUS PCR System</td>
			<td style="width:115px;">&#160;Roche Diagnostics, USA</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">25384-302</td>
			<td style="width:171px;">For holding the embryos during the microinjection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Crisco</td>
			<td style="width:115px;">The J.M. Smucker Company</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:136px;">Holtfreter`s solution</td>
			<td style="width:115px;">Home Made</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Doxycycline hyclate USP (monohydrate)</td>
			<td style="width:115px;">Letco Medical</td>
			<td style="width:99px;">690904</td>
			<td style="width:171px;">Antibiotic added to Holtfreter&#39;s solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of crispr/cas9 protein into channel catfish, ictalurus punctatus, embryos for gene editing

È stato sequenziato il genoma completo del channel catfish, Ictalurus punctatus, portando a maggiori opportunità per studiare la funzione del gene di pesce gatto della manica. Knockout del gene è stato utilizzato per studiare queste funzioni di gene in vivo. Il cluster regolarmente intervallate proteine brevi ripetizioni/CRISPR palindromi associato 9 (CRISPR/Cas9) sistema è un potente strumento utilizzato per modificare le sequenze di DNA genomic per alterare la funzione del gene. Mentre l'approccio tradizionale è stato introdurre gli embrioni di singola cellula attraverso microiniezioni CRISPR/Cas9 mRNA, questo può essere un processo lento e inefficiente nel pesce gatto. Qui, un protocollo dettagliato per il microinjection di embrioni di pesce gatto della manica con CRISPR/Cas9 proteina è descritto. Brevemente, le uova e lo sperma sono stati raccolta e quindi artificiale fecondazione eseguita. Le uova fecondate sono state trasferite in una piastra Petri contenente soluzione di Holtfreter. Volume di iniezione è stato calibrato e poi guida RNAs/Cas9 targeting per il pedaggio/interleukin 1 recettore dominio contenenti adattatore molecola (TICAM 1) gene e ramnosio binding lectin (RBL) gene sono stati microiniettati in tuorlo di embrioni di topo. Il Ko del gene era successo come indels sono stati confermati dal sequenziamento del DNA. Le alterazioni della sequenza di proteina preveduta a causa di queste mutazioni incluso frameshift e troncato proteine a causa di codoni di stop prematuri.

Per dimostrare l'efficienza del protocollo microiniezione, gRNAs progettato per indirizzare il pesce gatto della manica pedaggio/interleukin 1 dominio contenenti adattatore molecola (TICAM1) del gene del recettore e ramnosio binding lectin (RBL) gene sono stati microiniettati.
TICAM 1 Sequenziamento del DNA di vettori da diverse colonie da pool, clonati prodotti di PCR ha rivelato le mutazioni indel indotte n...

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Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Un protocollo di microiniezione semplice ed efficiente per l'editing di gene in embrioni di pesce gatto della manica usando il sistema CRISPR/Cas9 è presentato. In questo protocollo, guida RNA e proteina Cas9 erano microiniettati in tuorlo di embrioni di topo. Questo protocollo è stato convalidato battendo fuori due geni immuno-correlati di pesce gatto della manica.

Microinjection di proteine CRISPR/Cas9 in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embrioni per Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

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QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

Mapping QTL e modifica CRISPR / Cas9 per identificare un gene di resistenza alla droga in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

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Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

Presentazione di un Gene Knockout direttamente nello stadio Amastigote di Trypanosoma cruzi Utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CrispR-Cas9-Mediato Genome Editing nel Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microiniezione embrionale per CRISPR/Cas9 Mutagenesi

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...