Questo metodo consente l'isolamento di piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato con una purezza superiore a quella raggiunta dalla classica ultracentrifugazione differenziale. Questa tecnologia è semplice, conveniente e facile da usare, che può fornire supporto metodologico per lo studio di piccole vescicole extracellulari. Per iniziare, rimuovere il campione di tessuto dal congelatore a 80 gradi Celsius.
Posizionare circa 400 milligrammi di tessuto in un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri sulla ghiacciaia e tritare finemente il tessuto con un bisturi. Trasferire il tessuto in una piastra a sei pozzetti con 1,5 millilitri della soluzione digestiva. Quindi, posizionare la piastra sullo shaker di decolorazione del transfert e incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti per la completa dissociazione del tessuto del cancro del fegato e il rilascio delle piccole vescicole extracellulari o sEV.
Dopo l'incubazione, posizionare la piastra a sei pozzetti sulla ghiacciaia. Aggiungere 80 microlitri di inibitore della fosfatasi e 200 microlitri di soluzione completa di inibitore della proteasi per fermare la digestione. Quindi, trasferire la soluzione digestiva in un filtro cellulare da 70 micrometri posto su un tubo da centrifuga da due millilitri e filtrarlo lentamente per rimuovere eventuali detriti di tessuto di grandi dimensioni.
Centrifugare il filtrato a 500 g per 10 minuti per rimuovere i piccoli detriti tissutali e raccogliere il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da due millilitri. Centrifugare il surnatante a 3.000 g per 20 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire con cautela il surnatante in una nuova provetta da centrifuga fino a quando la punta della pipetta sta per toccare i detriti bianchi sul fondo.
Dopo aver ripetuto la centrifugazione del liquido rimanente, raggruppare il surnatante nel tubo senza disturbare i detriti. Centrifugare il surnatante raccolto a 12.000 g per 20 minuti e trasferire 900 microlitri di surnatante in una provetta ultracentrifuga da 4,7 millimetri. Ripetere la centrifugazione del liquido rimanente, quindi raccogliere e mescolare entrambi i surnatanti nello stesso tubo di ultracentrifuga.
Riempire completamente il tubo con PBS. Centrifugare il surnatante a 100.000 g per 60 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet riempiendo il tubo ultracentrifuga con PBS.
Dopo aver ripetuto la centrifugazione a 100.000 g per 60 minuti, risospendere il pellet con 50 microlitri di PBS. Aspirare la sospensione sEV utilizzando una siringa sterile da un millilitro e filtrarla attraverso un filtro a membrana da 0,22 micrometri in una provetta da centrifuga da 600 microlitri. Conservare il filtrato a 80 gradi Celsius per ulteriori analisi.
Utilizzare un citometro a flusso di nanoparticelle per determinare la distribuzione dimensionale e la purezza dei sEV. Controllare il volume della soluzione detergente. Quindi, notare la differenza tra i livelli della guaina e del liquido di scarto.
Dopo 20 secondi dall'accensione dell'alimentatore principale dello strumento, accendere il computer. Attendere i segnali acustici che indicano che lo strumento è collegato correttamente per eseguire il software. Fare clic su Start Up per accendere la fotocamera, il laser e la pompa dell'aria.
Quindi, fare clic su Sheath Flow e selezionare Start Up.Posizionare l'acqua ultrapura sulla piattaforma di carico. Dopo quattro minuti, fare clic su Campione e potenziamento, quindi selezionare Scarica nel campione. Dopo 30 secondi, posizionare il tubo bianco sulla piattaforma di carico.
Fare clic su Campione, selezionare Boosting, quindi selezionare Scarica nel campione. Quindi, posizionare il tubo contenente l'acqua ultrapura sulla piattaforma di carico. Contemporaneamente, fai clic su Campione e Boosting, seguito da Sheath Flow e Purge.
Fare clic su Operazione manuale e posizionare il tubo di concentrazione delle particelle sulla piattaforma di carico. Quindi, fare clic su Campione, selezionare Potenziamento per un minuto e contemporaneamente selezionare Controllo di qualità delle nanosfere di silice fluorescente standard a 250 nanometri in Informazioni campione. Selezionare Campionamento da campione e accendere il rilevatore facendo clic su SPCM.
Quindi, fai clic su Campionamento automatico e inserisci 1.0 in Set di campionamento per fissare la pressione a un kilopascal. Fare clic sulla barra degli strumenti e selezionare Segnale grande. Regolare la posizione orizzontale del laser e impostare il laser su due micrometri.
Quindi, fai clic continuamente su L e R per assicurarti che il segnale sia forte e uniforme. Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che passa automaticamente a Buffer al termine. Quindi, salvare i dati in File NFA e fare clic su Campione per selezionare Scarica.
Posizionare il tubo della soluzione detergente sulla piattaforma di carico. Fare clic su Campione, selezionare Boosting e dopo un minuto fare clic su Campione e scarica. Utilizzare acqua ultrapura per rimuovere la soluzione detergente residua dalla punta capillare.
Posizionare il tubo standard di dimensioni delle particelle sulla piattaforma di carico e fare clic su Sample Boosting per un minuto. Selezionare il controllo di qualità da 68 a 155 S16M-Exo in Informazioni campione e fare clic su Campione, quindi su Campionamento. Quindi, fai clic sulla barra degli strumenti e seleziona Piccolo segnale.
Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che passa automaticamente a Buffer al termine. Quindi, salvare i dati in un file Nfa e fare clic su Campione per selezionare Scarica. Dopo aver rimosso i residui con la soluzione detergente, posizionare il tubo PBS sulla piattaforma di carico ed eseguire i passaggi dimostrati per il tubo standard di granulometria.
Quindi, pulire la punta capillare come dimostrato in precedenza e caricare il campione sEV per analizzare i dati descritti in precedenza per il tubo standard di dimensione delle particelle. I sEV purificati sono stati esaminati al microscopio elettronico a trasmissione, che ha rivelato la presenza di sEV con una morfologia a forma di coppa. È stata effettuata la citometria a flusso per i sEV.
E la dimensione delle particelle variava da 40 a 200 nanometri, e la dimensione media delle particelle era di 89 nanometri. La purezza dei sEV arricchiti è risultata essere del 68,32%I marcatori proteici di sEV come CD63, CD9 e TSG101 sono stati rilevati dal western blot. GM130 è stato utilizzato come marcatore di controllo negativo dei sEV, che è stato trovato nelle cellule tissutali ma non nei sEV.
È fondamentale eseguire le fasi della digestione enzimatica, dell'ultracentrifugazione differenziale e della filtrazione a membrana con la massima cura per garantire la purezza delle piccole vescicole extracellulari.
