Le nanoparticelle proteiche autoassemblanti, o SAPN, possono essere utilizzate per sviluppare vaccini contro varie malattie infettive. Questo metodo descritto qui può essere utilizzato per purificare, riformlicare e caratterizzare i SAPN contenenti un fascio a sei eliche. Questa nanoparticella può presentare antigeni trimerici in una conformazione nativa.
Con lievi modifiche, questo metodo può essere applicato ad altri innovativi costrutti di vaccino SAPN. Inoltre, può essere facilmente trasferibile alla produzione su larga scala per studi clinici. Per la lisi dell'E.coli raccolto che esprime il fascio a sei eliche SAPN, utilizzare una sonda con la potenza di sonicazione di 150 watt con quattro secondi di sonicazione e sei secondi di riposo, per sonicare pellet batterici rimescolati in 40 millilitri di tampone senza imidazolo sul ghiaccio per cinque minuti.
Centrifugare il lysate cellulare per generare un supernatante chiarificato e trasferire il supernatante in un pallone sterile da 150 millilitri. Quindi, portare il campione fino a un volume finale di 100 millilitri con tampone fresco privo di imidazolo. Per isolare la proteina di interesse, aprire il software FPLC e fare clic sull'opzione Nuovo metodo.
Nel menu Impostazioni metodo aprire il menu a discesa Posizione colonna e selezionare Porta C1 3. Nel menu a discesa Mostra per tecnica selezionare Affinità. Nel menu a discesa Tipo di colonna selezionare Altri, Hp HisTrap e cinque millilitri.
Le caselle Volume colonna e Pressione verranno automaticamente impostate sui valori appropriati. Fate clic su Struttura metodo (Method Outline) e trascinate i pulsanti Equilibrazione e Applicazione di esempio, tre pulsanti Lava colonna e il pulsante Eluizione dal menu di scelta rapida Libreria di fasi accanto alla freccia prima di chiudere il menu Libreria di fasi. Fare clic su Equilibrazione e impostare i valori elencati nella tabella su Buffer iniziale B, 4%Buffer finale B, 4% e Volume colonna, cinque.
Fare clic su Applicazione di esempio. Nella casella Caricamento campione fare clic sul pulsante di opzione Per iniettare l'esempio sulla colonna con pompa campione e verificare che la casella accanto a Usa portata dalle impostazioni del metodo sia selezionata nella casella Iniezione campione con pompa di sistema. Modificare il valore della casella Volume in 100 millilitri e lo schema di raccolta delle frazioni da abilitare.
Deselezionare la casella Usa dimensione frazione da Impostazioni metodo e modificare la dimensione frazione in quattro millilitri. Fare clic sul primo pulsante Lava colonna, impostare i valori elencati nella tabella su Buffer iniziale B, 4%Buffer finale B, 4% e Volume colonna, 10. Fate clic sulla casella Abilita schema raccolta frazione (Fraction Collection Scheme Enable) e deselezionate la casella Usa dimensione frazione (Use Fraction Size) da Impostazioni metodo (Method Settings).
Modificare la dimensione della frazione in quattro millilitri e fare clic sul secondo pulsante Lava colonna. Impostare i valori della tabella su Buffer iniziale B, 0%Buffer finale B, 0% e Volume colonna, cinque. Fate clic sulla casella Abilita schema raccolta frazione (Fraction Collection Scheme Enable) e deselezionate la casella Usa dimensione frazione (Use Fraction Size) da Impostazioni metodo (Method Settings).
Modificare la dimensione della frazione in quattro millilitri e fare clic sul terzo pulsante Lava colonna. Impostare i valori della tabella su Buffer iniziale B, 0%Buffer finale B, 0% e Volume colonna, 10. Fate clic sul pulsante Abilita schema raccolta frazioni (Fraction Collection Scheme Enable) e deselezionate la casella Usa dimensione frazione (Use Fraction Size from Method Settings).
Quindi, modificare la dimensione della frazione in quattro millilitri. Fare clic sul pulsante Eluizione e fare clic con il pulsante destro del mouse sulle informazioni nella tabella. Nel menu a comparsa fare clic su Elimina passaggio e trascinare il pulsante Sfumatura isocratica nella tabella due volte, in modo che siano disponibili due voci.
Impostare il valore della prima voce su Buffer iniziale B, 30%Buffer finale B, 30% e Volume colonna, 10. Impostare il valore della seconda voce su Buffer iniziale B, Buffer finale B 100%,100% e Volume colonna, 10. Fare clic sul pulsante Abilita schema raccolta frazioni e fare clic sulla casella Usa dimensione frazione da impostazioni metodo.
Quindi, fare clic su Salva con nome e denominare la purificazione dei file. Posizionare la pompa Un tubo dell'FPLC nel tampone di lavaggio privo di imidazolo e il tubo B della pompa nel tampone imidazolo da 500 millimolare. Posizionare il tubo della pompa del campione nel campione da 100 millilitri ed eseguire il programma di purificazione.
Quando è necessario il lavaggio isopropanolo del 60%, sospendere il programma, spostare il tubo A della pompa dal lavaggio privo di imidazolo nel lavaggio isopropanolo del 60% e riavviare il programma. Al termine del lavaggio, sospendere nuovamente il programma, restituire il tubo A della pompa al tampone di lavaggio privo di imidazolo e riavviare il programma di purificazione. Per valutare la purezza della proteina purificata, combinare prima le frazioni dal flusso attraverso, lavare uno, lavare due e lavare tre passaggi, in singoli tubi conici da 50 millilitri.
Successivamente, mescolare 15 microlitri per ogni tubo campione con 15 microlitri di tampone Laemmli 2X in singoli tubi di microcentrifugo da 0,5 millilitri e denaturare i campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, impostare un apparecchio di funzionamento in gel con tre gel di poliacrilammide prefabbricati da quattro a 20% in tampone di funzionamento Tris-Glycine SDS-PAGE. Caricare otto microlitri di marcatore di peso molecolare sul primo pozzo di ogni gel e 30 microlitri di campione denaturato negli altri pozzi.
Eseguire i gel a 200 volt fino a quando la parte anteriore del colorante colpisce il fondo del gel e sciacquare brevemente i gel con acqua deionizzata prima di eseguire immediatamente l'imaging con un sistema di imaging privo di macchie. Quindi, identificare le frazioni che contengono bande proteiche con le dimensioni corrette e mettere in comune queste frazioni. Per il refolding SAPN a sei eliche bundle, aggiungere da 10 a 20 millilitri di proteine raggruppate a una cassetta di dialisi cut-off a peso molecolare da 10 kilodalton.
Dializzare la cassetta in otto urea molare, Tris da 20 millimolare, 5% di glicerolo e TCEP da cinque millimolare a temperatura ambiente durante la notte. La mattina seguente, diminuire la concentrazione di urea nel tampone di dialisi gradualmente di due molari ogni due ore per dializzare lentamente l'urea dal campione. Quando la concentrazione di urea raggiunge due molari, spostare l'apparato dialitico a quattro gradi Celsius e dializzare il campione in urea 120 millimolare, Tris da 20 millimolare e 5% di glicerolo durante la notte per completare il ripieroiezione.
La mattina seguente, rimuovere la proteina riformuplicata dalla cassetta e filtrare il pacchetto a sei eliche SAPN attraverso un filtro siringa al fluoruro di polivinilidene da 0,22 micrometri. Per misurare la dimensione media delle particelle del fascio a sei eliche SAPN, aggiungere 45 microlitri di SAPN a fascio a sei eliche a una cuvetta usa e getta e posizionare la cuvetta nella macchina DLS. Successivamente, creare un nuovo file di misurazione ed eseguire una procedura operativa standard prescritta per le proteine in urea 120 millimolare, Tris da 20 millimolare e tampone di glicerolo al 5% a 25 gradi Celsius.
Quindi, inizia la misurazione. La dimensione della media Z, il PDI e i risultati della distribuzione verranno calcolati per ogni esecuzione. La macchina leggerà il campione cinque volte.
Questo fascio di sei eliche completamente assemblato SAPN è costruito su sequenze proteiche che si prevede si pieghino in una particella che contiene 60 copie del monomero. Il lisato a cellule totali è stato utilizzato per purificare i monomeri SAPN a sei eliche con FPLC usando una colonna di nichel, dimostrando che la proteina eluizzava sia a imidazolo da 150 che da 500 millimolare. Il cromatogramma mostra anche altri due picchi a 185 e 210 millilitri volume totale corrispondente rispettivamente al lavaggio isopropanolo e al lavaggio senza imidazolo.
Le frazioni e la purezza della proteina ricombinante potrebbero essere identificate da gel gradiente SDS-PAGE con la proteina di interesse situata principalmente nella frazione 68-79. L'analisi western con anticorpi anti-His e anti-167D4 ha indicato che le frazioni raggruppate erano effettivamente la proteina di interesse. Le macchie hanno anche dimostrato la presenza dei multimeri SAPN a sei eliche.
I campioni che contenevano i monomeri proteici di interesse sono stati piegati nel fascio di sei eliche completamente assemblato SAPN per dialisi e distribuzione delle dimensioni delle particelle è stato determinato da DLS e analisi di tracciamento delle nanoparticelle. La visualizzazione mediante microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato singole particelle SAPN a sei eliche ben formate con la distribuzione delle dimensioni ottenuta dalle due tecniche di dimensionamento delle particelle. Il passo più importante in questo protocollo è il ripiezione del bundle a sei eliche SAPN.
Il pH corretto e la forza ionica del tampone di ripiezione sono essenziali. Utilizzando un lavaggio isopropanolo durante la purificazione, siamo stati in grado di ridurre l'LPS contaminante a un livello molto basso. Tuttavia, LPS può essere ulteriormente ridotto utilizzando una colonna di scambio di anion, se necessario.
Questa tecnologia può essere facilmente adattata per l'applicazione umana. Un SAPN espresso in batteri è già stato scalato per un prossimo studio clinico sulla malaria di fase 1/2a.
