Questo protocollo fornisce linee guida su come evitare la contaminazione con endotossina durante l'isolamento di vescicole extracellulari da supernatanti di coltura cellulare e su come valutarle correttamente. Il vantaggio principale di questo protocollo è che ogni laboratorio che si occupa di EV può limitare la contaminazione da endotossine mantenendo una procedura asettica e utilizzando apparecchiature semplici e ampiamente disponibili. Tutti coloro che stanno provando questa tecnica per la prima volta dovrebbero iniziare con nuovi media, reagenti e articoli in plastica che sono a bassa endotossina, non pirogeni marcati.
Per questo protocollo, utilizzare reagenti privi di endotossine, acqua, terreni di coltura, PBS filtrato, FBS a bassissima endotossina e tubi per ultracentrifuga. Per iniziare, raccogliere il surnatante da linee cellulari SW480 e SW620 precedentemente coltivate in tubi da 15 millilitri opportunamente etichettati. Rimuovere i detriti cellulari centrifugando il surnatante a 500 x g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Senza disturbare i detriti, raccogliere il surnatante in un nuovo tubo etichettato e centrifugare a 3.200 x g per 12 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire con attenzione 45 millilitri di surnatante in un tubo sterile da 50 millilitri posizionato verticalmente, senza bagnare i bordi del tubo. Avvolgere il cappuccio del tubo con una pellicola sterile e trasparente e conservarlo verticalmente a meno 80 gradi Celsius per il successivo isolamento delle vescicole extracellulari.
Iniziare l'isolamento preparando filtri per siringhe da 0,22 micrometri, siringhe e tubi contenenti circa 90 millilitri di surnatante. Riempire una siringa con il surnatante e fissare il filtro all'adattatore dell'ago. Filtrare il surnatante attraverso il filtro in un tubo da 50 millilitri.
Pipettare sette millilitri del filtrato in un tubo di ultracentrifuga preparato e centrifugare a 100.000 x g per due ore a quattro gradi Celsius. Utilizzare una pipetta Pasteur sterile per eliminare il surnatante. Tirare i pellet in un tubo ultracentrifugo utilizzando una punta di pipetta filtrata lunga.
Risciacquare le vescicole extracellulari aggiungendo sette millilitri di PBS filtrato privo di endotossine. Dopo l'ultracentrifugazione, scartare il surnatante utilizzando una pipetta Pasteur sterile e risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS privo di endotossine. Trasferire la sospensione in una provetta sterile a basso legame proteico da 1,5 millilitri.
Quindi trasferire 10 microlitri di sospensione in un nuovo tubo da 1,5 millilitri per ulteriori analisi. Avvolgere il cappuccio del tubo e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Ora, in un nuovo tubo, diluire un microlitro di sospensione utilizzando PBS filtrato in un rapporto di 1 a 1000 per l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle.
Per eseguire l'analisi di blotting, mescolare prima 20 microgrammi di campioni con un buffer di caricamento. Incubare i campioni a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi caricare 20 microgrammi del campione in ciascun pozzetto di un gel di poliacrilammide dal 10 al 14% con SDS ed eseguire l'elettroforesi per 45 minuti a 150 volt, con tampone corrente.
Quindi, posizionare il gel in una macchina di trasferimento con tampone Towbin ed eseguire un trasferimento semi-secco di proteine su una membrana di difluoruro di polivinilidene a 25 volt per un'ora. Bloccare la membrana con 1% BSA incubandola per un'ora su un bilanciere. Aggiungere anticorpi diluiti BSA, anti-CD9 o anti-Alix, alla membrana e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius su un bilanciere.
Dopo aver rimosso gli anticorpi, lavare la membrana tre volte con 10 millilitri di TBST per 10 minuti. Ora aggiungi l'anticorpo secondario anti-coniglio o anti-topo di capra e incubare di nuovo su un rocker per un'ora a temperatura ambiente. Eliminare l'anticorpo e lavare la membrana come dimostrato in precedenza.
Versare un millilitro della soluzione contenente substrato e luminolo in un rapporto uguale sulla membrana. Posizionare immediatamente la membrana in un sistema di imaging e visualizzare le bande proteiche sullo schermo. Nel presente studio, l'analisi western blot ha confermato la presenza di due marcatori di vescicole extracellulari, CD9 e Alix.
Le dimensioni medie e le concentrazioni delle vescicole isolate sia da SW480 che da SW620 erano simili. La stimolazione del monocita con diverse dosi di lipopolisaccaride, o LPS, ha mostrato che la dose più bassa di LPS che consente la secrezione di interleuchina 10 e il fattore di necrosi tumorale nei monociti era di 50 picogrammi per millilitro. Il test cromogenico LAL ha indicato che la contaminazione da LPS delle vescicole extracellulari era di circa 50 picogrammi per millilitro per entrambe le linee cellulari.
La cosa più importante da ricordare è l'uso di reagenti privi di LPS o impoveriti e la misurazione LPS di routine in ogni fase della procedura. Prevenire la contaminazione da endotossine è più facile che eliminarla. Il protocollo proposto limita la possibilità di risultati falsi a causa della contaminazione delle EV con endotossina e consente di valutare l'attività delle EV per cellula.
Il protocollo proposto è utile per i ricercatori che lavorano con cellule sensibili alle endotossine, come monociti, cellule dendritiche e macrofagi.
