La stabilità di conservazione delle vescicole cellulari extra è un parametro importante per il loro potenziale uso terapeutico. Il nostro protocollo fornisce uno strumento facilmente applicabile per valutare in che modo l'archiviazione ha effetti sulle vescicole. Il principale vantaggio della nostra tecnica è che introducendo la glucuronidasi come marcatore esogeno, le vescicole extracellulari derivate da diverse cellule madri possono essere facilmente confrontate per quanto riguarda la loro memorizzabilità.
Il frazionamento asimmetrico del flusso del campo di flusso, o AF4, è una lieve alternativa alla purificazione cromatografica di esclusione delle dimensioni per composti molto sensibili. Perché i composti incontrano meno stress nel canale. Poiché la glucuronidasi è un enzima sensibile, la qualità delle residenze beneficia di una pianificazione approfondita e dell'esecuzione delle fasi di purificazione e analisi back-to-back.
Dopo aver coltivato la linea cellulare di interesse secondo le condizioni standard per quelle cellule, sostituire il supernatante con mezzo impoverito di vescicola cellulare senza siero o extra e riportare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare per ulteriori 24-72 ore. Al termine dell'incubazione, raccogliere il super parto da ogni pallone e centrifugare i campioni per sedimentare le cellule. Raccogliere con cura il mezzo condizionato della cella senza disturbare il pellet.
E centrifuga di nuovo il mezzo per rimuovere detriti cellulari e grandi aggregati. Quindi trasferire con cura i supernaganti in tubi ultracentrifugo. Se si utilizza un rotore ad angolo fisso, contrassegnare l'orientamento dei tubi nella centrifuga per facilitare il recupero del pellet di vescicola extracellulare dopo la centrifugazione.
Al termine dell'ultracentrifugazione, utilizzare una pipetta sierologica per scartare con cura il supernatante senza disturbare il pellet di vescicola extracellulare. A 200 microlitri di 0,2 micrometri pori filtrato PBS al supernatante residuo del primo tubo ultracentrifugo. Dopo aver sospeso il pellet, trasferire la sospensione vescicolare extracellulare risultante al tubo successivo per la sospensione del pellet successivo fino a quando tutti i pellet di vescicola extracellulare non sono stati rimorsiditi.
Aggiungere la beta glucuronidasi alla soluzione finale di pellet rimescolato a una concentrazione finale di 1,5 milligrammi per millilitro. E saponina ad una concentrazione finale di 0,1 milligrammi per millilitro. Quindi mescolare bene vortice per tre secondi e posizionare la reazione a temperatura ambiente per 10 minuti con flicking delicato intermittente.
Una volta che la glucuronidasi è stata incapsulata, assicurarsi di eseguire tutte le successive fasi di valutazione della vescicola di purificazione lo stesso giorno per ottenere risultati imparziali di stabilità dello stoccaggio. Avere una colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni equilibrata con almeno due volumi di colonna di PBS pronti a purificare il pellet immediatamente dopo l'incubazione di saponina. Per purificare, aggiungere fino a 400 microlitri di sospensione vescicolare extracellulare alla colonna.
Quindi raccogliere una frazione millilitro dell'eluato. Per conformare la separazione delle vescicole extracellulari dalle proteine contaminanti e dalla glucuronidasi libera, misurare la concentrazione proteica mediante saggio di acido bicinchoninico secondo le istruzioni dei produttori. Utilizzando parametri ottimizzati per il rispettivo tipo di strumento e vescicola, utilizzare uno strumento di analisi di tracciamento delle nano particelle per misurare la dimensione e la concentrazione della vescicola extracellulare.
Per misurare l'attività della glucuronidasi, aggiungere 25 microlitri di fluorescina di-beta-D-glucuronide appena preparata a 125 microlitri delle vescicole extracellulari purificate e aggiungere il campione a un pozzo di una piastra nera da 96 pozzetti. Misurare la produzione di fluorescina a zero volte su un lettore di lastre con un'eccitazione di 480 nanometri e un'emissione di 516 nanometri. Coprire saldamente la piastra con un foglio di plastica trasparente per ridurre l'evaporazione.
Quindi incubare la piastra protetta dalla luce per 18 ore a 37 gradi Celsius. Misurare la produzione di fluorescina di 18 ore sul lettore di lastre come appena dimostrato. Per la litofilizzazione vescicolare extracellulare, aggiungere quattro milligrammi per millilitro di trealosio alle vescicole purificate.
E congelare le vescicole a meno 80 gradi Celsius per almeno un'ora. Per lyophilizzare i campioni, impostare la temperatura di conservazione di un lyophilizer a 15 gradi Celsius e la pressione a 0,180 millibar. Asciugare le vescicole in queste condizioni per 46 ore.
Alla fine della fase di asciugatura principale, impostare la temperatura dello scaffale a 25 gradi Celsius e la pressione a 0035 millibar e asciugare i campioni per due ore in queste condizioni. Quindi conservare i campioni liofilizzati a quattro gradi Celsius. Per reidratare i campioni dopo la conservazione, aggiungere un volume d'acqua pari al volume della sospensione vescicolare extracellulare prima della lyophilization.
Per valutare l'attività enzimatica dopo lo stoccaggio, caricare uno strumento AF4 con PBS filtrato da 0,1 micrometri appena preparato per la fase mobile e inserire una membrana filtrante da 0,1 micrometri nel filtro di ingresso di picco dopo la pompa per ridurre il rumore delle particelle dal solvente. Dopo lo smontaggio, pulire il piccolo canale per AF4 con acqua millEq. Idratare una nuova membrana di cellulosa rigenerata con un peso molecolare tagliato da 30 kilodalton e posizionare la membrana sopra il fret con il lato lucido verso l'alto.
Posizionare un ampio distanziale di 350 micrometri sotto la metà superiore del canale e assemblare le parti del canale. Utilizzando un cacciavite di coppia, stringere le viti prima a una coppia di cinque newtonmetri, quindi a una coppia di sette newtonmetri. Stringendo le viti intorno al blocco in un motivo incrociato.
Collegare i canali di ingresso, uscita e porta di flusso incrociato all'eclissi. Quindi da almeno tre vecchi campioni per equilibrare la membrana. Programma un'esecuzione di frazionamento con il flusso del rivelatore e il flusso di messa a fuoco impostati su un millilitro al minuto e un flusso di iniezione di 0,2 millilitri al minuto.
Dopo un minuto di pre-messa a fuoco, iniettare il campione per un periodo di 10 minuti nella messa a fuoco e iniettare il passaggio, prima di diminuire il flusso trasversale da due millilitri al minuto a 0,1 millilitri al minuto nel corso di otto minuti. Terminare la corsa di frazionamento con una fase di eluizione senza flusso incrociato per 10 minuti e aggiungere una fase di lavaggio di eluizione e iniezione, seguita da un'eluizione. Quindi equilibrare il canale per la corsa successiva con un flusso trasversale iniziale di due millilitri al minuto e impostare il rilevatore UV su 280 nanometri.
Una volta impostati tutti i programmi, iniettare 300 microlitri del campione e registrare i segnali UV e di dispersione della luce nel software ASTRA. Dopo 12 minuti e mezzo, iniziare a raccogliere una frazione millilitro fino a 27 minuti dopo l'iniezione. Quindi eseguire un saggio di glucuronidasi e un'analisi di tracciamento delle nano particelle come dimostrato.
Qui, il recupero delle particelle e la dimensione delle vescicole extracellulari isolate dalle cellule endoteliali vascolari umane dopo sette giorni di conservazione in condizioni diverse sono mostrate rispetto a un campione fresco. Le vescicole sono state successivamente sottoposte a purificazione AF4 ed è stata misurata l'attività della glucuronidasi per particella. Sia la cromatografia ad esclusione di dimensioni che l'AF4 sono riusciti a separare la vescicola extracellulare dalla glucuronidasi libera.
A causa del più alto grado di separazione per AF4 tra particelle ed enzima libero, la contaminazione delle frazioni contenenti vescicole è meno probabile. La purificazione AF4 dopo lo stoccaggio rimuove l'enzima libero dai campioni e quindi riduce la quantità di attività enzimatica recuperata per particella. Questo effetto è più evidente dopo la conservazione a quattro gradi Celsius, per i quali si osserva una riduzione di 2/3.
Omettere questo ulteriore passaggio di purificazione può portare a un presupposto errato sulla stabilità enzimatica. La microscopia elettronica a trasmissione non rivela grandi differenze di forma per le vescicole extracellulari lyophilized senza crioprotettivo. L'imaging a scansione di microscopia elettronica, tuttavia, rivela la presenza di aggregati all'interno dei campioni lyophilizzati che non si trovano nei campioni meno 80 gradi immagazzinati.
È fondamentale che l'enzima libero venga rimosso dalle vescicole prima del saggio sulla glucuronidasi. Pertanto, la tecnica utilizzata per la purificazione della vescicola deve essere accuratamente valutata. Le particelle purificate potrebbero anche essere esaminate in termini di carica superficiale per scoprire se lo stoccaggio ha cambiato la composizione naturale delle proteine di membrana o degli zuccheri.
Con la nostra tecnica, è possibile ottenere una prima indicazione sulla stabilità di conservazione della vescicola extracellulare, anche quando non ci sono marcatori o saggi specifici noti per l'attività disponibile.
