Il protocollo qui descritto ci permette di indagare la funzione di una chemiochina e il comportamento del macrofago in vivo. La maggior parte dei modelli sperimentali esistenti di chemiotassi cellulare si basano su esperimenti su cellule in vitro. Ma gli esperimenti in vitro a volte sono troppo semplici per modellare l'ambiente complesso in vivo.
Inoltre, potrebbero non rappresentare l'abilità di chemioa attrazione in vivo. Questi metodi utilizzano il vantaggio specifico del pesce zebra per l'osservazione diretta del comportamento cellulare, che è difficile per i topi. Inizia generando costrutti transgenici TGFABP-10A interleuchina-34.
Iniettare i costrutti interleuchina-34 FABP-10A in uno stadio cellulare Tg(mpeg1:GFP)transgenico e un embrione di pesce di tipo selvatico insieme alla MRNA traspostasi. Sollevare e raccogliere gli embrioni secondo le istruzioni del manoscritto. Quindi, fissarli con paraformaldeide al 4% durante la notte a 4 gradi Celsius o per due ore a temperatura ambiente.
Dopo la fissazione, lavare gli embrioni con PBST tre volte per cinque minuti per lavaggio. Disidratare gli embrioni separatamente con il 50% di metanolo in PBST, seguito dal 100% di metanolo, quindi passare al metanolo fresco al 100% e conservarli a -20 gradi Celsius per almeno 2 ore. Quando è pronto per l'ibridazione della sonda, reidratare gli embrioni separatamente nel 50% di metanolo in PBST.
Quindi, lavarli con PBST tre volte per cinque minuti per lavaggio. Digerire gli embrioni con proteinasi K in PBST a temperatura ambiente. Quindi, scartare la soluzione di digestione e ripetere la fissazione con paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente.
Dopo la fissazione, lavare gli embrioni due volte con PBST per 10 minuti per lavaggio. Eseguire la preibridizzazione con buffer di ibridazione riscaldato a 65 gradi Celsius per almeno un'ora. Quindi, preriscaldare la sonda interleuchina-34 a 65 gradi Celsius per 10 minuti.
Riciclare il buffer di ibridazione nel tubo originale ed eseguire l'ibridazione con la sonda preriscaldata a 65 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare gli embrioni con 50%formamide e 2X SSCT seguito da 2X SSCT e poi 0.2X SSCT a 65 gradi Celsius. Ripetere ogni lavaggio tre volte con 20 minuti per lavaggio.
Quindi, lavare gli embrioni tre volte con PBST per cinque minuti per lavaggio. Bloccare i campioni con 600 millilitri di tampone di blocco per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 400 microlitri di soluzione anticorpale HRP anti-digoxigenina e incubare gli embrioni a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo e lavare gli embrioni sei volte con PBST per 20 minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sciacquare ogni campione con 30 microlitri di 1X più diluente di amplificazione per cinque minuti. Incubare i campioni nella soluzione di lavoro della tiroramina del fluorofo per cinque-15 minuti al buio.
Estensione del tempo di incubazione a 30 minuti se i segnali sono deboli. Quindi, lavare gli embrioni con PBST tre volte per 10 minuti per lavaggio. E incubarli con l'anticorpo primario a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, lavare gli embrioni cinque volte con PBST per 30 minuti per lavaggio e incubarli con gli anticorpi secondari a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare gli embrioni tre volte in PBST per 10 minuti per lavaggio e conservarli nel 70% di glicerolo al buio a quattro gradi Celsius o -20 gradi Celsius più a lungo. Prima dell'imaging, utilizzare un microscopio a fluorescenza per selezionare gli embrioni doppi positivi DS rossi e GFP.
Per montare il pesce, utilizzare un bagno di metallo per riscaldare un millilitro dell'1% di agarosio fuso basso fino a oltre 90 gradi Celsius. Quindi, raffreddarlo a temperatura corporea e mescolare in 50 microlitri dello 0,2% di tricaina. Trasferire gli embrioni anestetizzati su un piccolo piatto montato con uno scivolo di copertura sul fondo.
Rimuovere l'acqua circostante e far cadere lentamente l'agarosio a bassa fusione sugli embrioni. Impostare con cura la posizione del pesce prima che l'agarosio si sia solidificato, mantenendo l'area epatica vicino allo scivolo di copertura. Una volta che l'agarosio si è solidificato, coprirlo con cura con un altro strato di agarosio per rinforzarlo.
Posizionare il piatto sul tavolo porta microscopio confocale, coprire il pesce con la soluzione E2 con tricaina e iniziare l'imaging. Per utilizzare il microscopio confocale, aprire il software Zen Black 2.3 e fare clic su individua, quindi incubare, quindi impostare la temperatura su 29 gradi Celsius. Fare clic sul menu di acquisizione e selezionare la modalità di scansione e i laser necessari nel menu di configurazione intelligente.
Quindi selezionare Z-stack e posizione. Fate clic sul menu di progettazione sperimentale e selezionate Abilita esperimento multiblobloglio nel primo blocco per trovare l'esempio con un ingrandimento basso. Quindi, passare all'ingrandimento elevato e lasciare che l'area osservata al centro del campo visivo.
Impostare le informazioni sulla posizione e sulla pila Z. Quindi, seleziona l'intensità del laser appropriata, gli strati di scansione e la velocità di imaging. Una volta che tutti i blocchi sono stati configurati, impostare il numero appropriato di cicli e iniziare la registrazione.
Questo protocollo è stato utilizzato per iniettare un interleuchina-34 specifico per il fegato sul plasmide di espressione in embrioni di pesce transgenico, i macrofagi sono stati etichettati con GFP. L'ibridazione e l'immunosocienza a montaggio completo in situ sono state utilizzate per analizzare l'espressione dell'interleuchina-34 e dei macrofagi etichettati GFP. I numeri delle cellule macrofagi sono stati analizzati quantitativamente in interiettati e costruiscono la regione epatica e di coda degli embrioni iniettati.
L'imaging dal vivo è stato utilizzato per osservare direttamente i macrofagi, etichettati come verdi, passando dal fegato di un pesce di controllo e migrando nel fegato di un interleuchina-34 sull'espressione del pesce. I passaggi importanti di questo protocollo includono la selezione di una linea transgenica adatta per etichettare la cellula di interesse. E tessuto appropriato per l'imaging della tua espressione di gene transgenico e un'adeguata finestra di tempo di osservazione.
Questa tecnica potrebbe essere applicata per studiare la funzione di altre chemiochine sul comportamento di altre cellule, come cellule T e neutrofili in vivo.
