Questo protocollo descrive una tecnica per indirizzare i farmaci di interesse per i macrofagi larvali di zebrafish per manipolare e valutare la funzione macrofagi. Questa tecnica ha vantaggi rispetto alle strategie tradizionali di somministrazione di farmaci come l'immersione garantendo che i farmaci siano specificamente mirati ai macrofagi attraverso l'incapsulamento liposoma. Se applicata ai modelli zebrafish di malattia con una componente infiammatoria, questa tecnica ha il potenziale per risolvere il modo in cui i macrofagi contribuiscono ai processi patologici.
Qui, dimostriamo l'utilità di questa tecnica prendendo di mira un farmaco inibitore delle specie di ossigeno mitocondriale-reattivo ai macrofagi per sopprimere l'attivazione. La microiniezione di liposomi caricati di farmaci nelle larve può essere impegnativa, poiché si dovrebbe fare attenzione a non causare eccessivi danni epiteliali, influenzando potenzialmente gli studi immunologici. La dimostrazione visiva di questo protocollo è importante perché coinvolge metodologie farmacologiche e intere di cellule vive animali che potrebbero non essere eseguite regolarmente in un singolo laboratorio.
Per preparare 10 milligrammi di liposomi in un pallone a fondo rotondo da 25 millilitri, aggiungere 31 nanomolari di blu marino e 300 nanomolari di un farmaco inibitore delle specie di ossigeno mitocondriale-reattivo al pallone. Sonicare brevemente per dissolversi completamente e rimuovere lentamente il solvente su un evaporatore rotante impostato su un bagno d'acqua Celsius di 45 gradi a 75 rotazioni al minuto sotto pressione del vuoto. Quando un film sottile lipidico secco si è formato all'interno delle pareti di vetro del pallone, asciugare ulteriormente il film per 45 minuti sotto azoto per facilitare la completa rimozione del solvente organico.
Successivamente, idratare il film con un millilitro di PBS e sigillare il pallone con pellicola di paraffina prima di agitare il pallone a mano su un bagno d'acqua Celsius di 60 gradi per 20 minuti. Dopo sette cicli di congelamento e scongelamento, utilizzare un mini-estrusore e membrane in policarbonato tracciato da un micrometro per estrudere i liposomi per due o sei cicli. Quando sono state ottenute grandi vescicole unilamellari, condensare i liposomi freschi in un pellet mediante ultracentrifugazione.
Incubare il pellet con un millilitro di soluzione 1%poloxamer 188 per 30 minuti a 45 gradi Celsius e 750 rotazioni al minuto in un ThermoMixer con attacco tubo microcentrifugo a due millilitri. Durante il post inserimento del poloxamero 188 nei liposomi, la corretta concentrazione di poloxamero, il tempo di incubazione e la temperatura sono importanti per raggiungere le caratteristiche fisicochimiche ottimali dei liposomi risultanti. Alla fine dell'incubazione, ultracentrifugare nuovamente la miscela nelle stesse condizioni di centrifuga e rimuovere il supernatante contenente qualsiasi polimero o farmaco non legato.
Quindi conservare i pellet liposomi a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce. Per determinare le dimensioni e il potenziale zeta dei liposomi, diluire la formulazione liposoma con acqua ultrapura con un rapporto uno a 100. Utilizzare un analizzatore dinamico di diffusione della luce per misurare la dimensione delle particelle, l'indice di polidispersità e il potenziale zeta in triplice copia a 25 gradi Celsius.
Per calcolare l'efficienza dell'intrappolamento e il caricamento del farmaco dei liposomi, sciogliere i liposomi in Triton X-100. Iniettare 20 microlitri del campione di liposoma disciolto in un sistema di cromatografia liquida ad alta pressione con una pompa quaternaria, un rivelatore array di diodi impostato a 230 nanometri e una colonna di tre micrometri, 250 volte 4,6 millimetri. Per preparare le larve transgeniche di zebrafish per l'iniezione, utilizzare forcep a punta fine per dechorionare manualmente 30 ore dopo la fecondazione e consentire agli embrioni di svilupparsi a 28,5 gradi Celsius fino a due giorni dopo la fecondazione.
Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio appropriato, diluire una formulazione liposoma preparata al momento a un rapporto uno a uno in PBS sterile e mescolare la soluzione per due o tre secondi con vortici. Versare abbastanza 3%cellulosa metile nel mezzo E3 nel coperchio di un piccolo coperchio piatto di coltura di 35 millimetri per formare un film sottile che copre l'intera superficie. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per raccogliere una piscina di circa 20-25 larve anestetizzate.
Lasciare che gli embrioni si concentrino sulla punta della pipetta per gravità e trasferire attentamente le larve al centro del coperchio del piatto di coltura di 35 millimetri con una soluzione minima. Utilizzare un caricatore microcapillare per disporre le larve con i loro anteri verso la parte superiore della piastra di iniezione con la superficie dorsale rivolta verso l'ago di microiniezione per l'iniezione nel ventricolo del cervello posteriore o con i loro anteri verso sinistra della piastra di iniezione con le superfici ventrali rivolte verso l'ago di microiniezione per iniezione nel seno velenoso. Utilizzare un caricatore microcapillare per riempire di nuovo un ago di iniezione con circa cinque microlitri della miscela di iniezione liposoma.
Montare l'ago in un micromanipolatore collegato a un supporto magnetico e a un iniettore di pressione e posizionare la configurazione al microscopio stereo. Utilizzare pini puliti e a punta fine per tagliare la punta dell'ago di microiniezione per generare un'apertura di circa cinque micrometri di diametro. Impostare l'iniettore su una durata dell'impulso di circa 50 millisecondi e una pressione di iniezione di circa 40 libbre per pollice quadrato.
Iniettare un bolo in una goccia di olio minerale posizionata sulle linee della griglia di un emocitometro per calibrare il volume da iniettare. Quindi regolare la durata dell'impulso e/o la pressione di iniezione fino a quando il diametro del bolo copre 2 1/2 delle linee della griglia più piccole. Iniettare con cura un nanolitro della miscela di iniezione liposoma nel ventricolo del ventricolo del cervello posteriore di ogni larva.
Immediatamente dopo le iniezioni, aggiungere il mezzo E3 alla piastra di iniezione e utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per agitare delicatamente le larve dalla cellulosa metile. Per visualizzare la superficie dorsale del cervello posteriore su un microscopio confocale dotato di una lente ad immersione in acqua, riempire prima un piatto di coltura di 35 millimetri a una profondità di cinque millimetri con mezzo di montaggio e lasciare che il mezzo polimerizzi. Scavare una piccola trincea nell'agarosio di area sufficiente per ospitare il sacco vitellino dell'embrione sperimentale e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica riempita con mezzo di montaggio fuso per raccogliere una larva anestetizzata.
Depositare immediatamente la larva nel piatto di coltura e utilizzare un caricatore microcapillare per orientare il lato ventrale del sacco tuorlo verso il basso nei fori scavati. Mantenere l'embrione in questa posizione fino a quando l'agarosio polimerizza. Sovrapporre l'embrione con mezzo E3 integrato con 200 microgrammi per millilitro di tricaina.
Per vivere l'immagine del ventricolo del ventricolo del cervello posteriore, selezionare l'obiettivo 20x e impostare il microscopio confocale su 512 per 512 pixel e uno zoom 2,5x. Quando i parametri del microscopio sono stati impostati, acquisire z-stack da 40 x tre micrometri che si estendono dalla superficie più dorsale del cervello posteriore usando l'imaging a due canali per immaginare i liposomi fluorescenti blu e i macrofagi fluorescenti verdi. Una volta ottenute tutte le immagini, caricare i file in un programma software di analisi delle immagini 3D appropriato.
Nella scheda Misurazione trascinare il protocollo Trova oggetti nello spazio Trascina attività qui per effettuare misurazioni. Selezionate il canale DAPI per evidenziare i liposomi e trascinate lo strumento Ispeziona attraverso le sezioni Z per rilevare i macrofagi carichi di liposomi. Per quantificare l'intensità di fluorescenza dei liposomi all'interno delle singole celle, trascinate il protocollo Clip in Regioni di interesse nello spazio Trascina attività qui per effettuare misurazioni e usate lo strumento Rettangolo per disegnare una casella intorno alla cella di interesse nelle quote X, Y e Z.
Quindi selezionate Crea elemento di misura (Make Measurement Item) dal menu a discesa Misure (Measurements) per generare un file di misurazione nella finestra della libreria. In questa tabella, vengono riepilogate le dimensioni, il potenziale zeta, il carico di farmaci e l'efficienza di intrappolamento dei liposomi prodotti. Come osservato, la dimensione delle particelle dei liposomi è simile e senza carico di farmaci, anche se la carica superficiale dei liposomi caricati da farmaci è leggermente più neutra dei liposomi di controllo solo con blu marino.
La microiniezione di liposomi marini etichettati blu nel ventricolo del ventricolo del cervello posteriore, come dimostrato, si traduce in un rapido assorbimento da parte dei macrofagi residenti che può essere facilmente quantificato con microscopia confocale di tre ore dopo l'iniezione. I neutrofili, tuttavia, sono raramente osservati contenere liposomi intracellulari. All'interno dei singoli macrofagi carichi di liposomi, i liposomi si accumulano all'interno dei compartimenti fagolysosomiali, che è necessario per la degradazione liposoma e il successivo rilascio di contenuto di farmaci nel citoplasma.
La consegna nel seno velenoso può consegnare i liposomi ai macrofagi caudali ematopoietici residenti nel tessuto attraverso la circolazione. La microiniezione di liposomi caricati con il farmaco inibitore dell'ossigeno mitocondriale-reattivo nel ventricolo del ventricolo del cervello posteriore può sopprimere significativamente la produzione di specie di ossigeno mitocondriale-reattivo a urato monosodico all'interno di macrofagi residenti in racchieri posteriori carichi di liposomi. Un'ulteriore convalida degli effetti soppressivi dei farmaci di interesse sugli stati di attivazione dei macrofagi può essere eseguita studiando l'espressione genica citochina proinflammatoria mediante ibridazione in situ a montaggio intero e il reclutamento temporale di neutrofili.
Usando questa tecnica, siamo stati in grado di indirizzare i farmaci ai macrofagi per confermare che un meccanismo immunometabolico guida la loro attivazione in un modello larvale di zebrafish di infiammazione gottosa acuta. I futuri adattamenti di questo protocollo potrebbero includere l'esecuzione di modifiche superficiali del liposoma per migliorare il targeting da macrofagi o per promuovere il targeting ad altre cellule immunitarie, come i neutrofili.
